Notchシグナルに関与するO-フコース型糖鎖の細胞分化・臓器形成における役割

O-岩藻糖型糖链参与Notch信号在细胞分化和器官形成中的作用

基本信息

批准号：
17046016
负责人：
上村和秀
金额：
$ 3.07万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17046016/
关键词：
Notch o-フコースノックアウトマウスリガンド結合

项目摘要

Notchシグナルは発生、細胞分化のさまざまな局面で重要な役割を担っており、その機能不全はまたT細胞性白血病やCADASILをはじめとする種々の疾患の原因であることが知られている。Notchの細胞外ドメインはO-フコース型糖鎖による修飾をうけており、この糖鎖修飾の第1段階を触媒するO-フコース転移酵素(O-Fut1)の欠損マウスはNotchと同様に胎生致死となる。研究代表者らはこの欠損マウスから樹立したES細胞を用いて、O-フコース型糖鎖の欠損によりリガンド結合能が失われること、また同欠損によりNotchの細胞表面発現はほとんど変化しないことを見いだしている。本年度はリガンド発現細胞との共培養によるNotchシグナリングアッセイを行い、O-フコース型糖鎖を欠損するES細胞ではリガンド依存的なNotch活性化がほぼ消失することを明らかにした。また、RNAiによりO-フコース転移酵素の発現をCHO細胞においてノックダウンしたところ、Notchリガンドの結合とリガンド依存的Notchの活性化の両者とも顕著な減弱が認められた。Notchのリガンド結合実験の特異性を確認する目的で、マウスNotch1の細胞外領域フラグメントをCHO細胞に発現させ、培地より回収精製することにより調製した。本フラグメントはマウスES細胞に対するNotchリガンドの結合を容量依存的に阻害した。また、特定のO-フコース修飾部位を改変した部分的糖鎖欠損型のNotch1細胞外領域フラグメントはマウスES細胞に対するNotchリガンドの結合をほとんど阻害しなかった。これらの結果から、Notch細胞外ドメインのO-フコース型糖鎖がリガンドの結合およびリガンド依存的Notchの活性化に必須であることが明確に示された。

Notch信号在发育和细胞分化的各个方面都起着重要作用，并且它们的功能障碍也是造成多种疾病的原因，包括T细胞白血病和Cadasil。 Notch的细胞外结构域是通过O-糖糖糖糖的修饰的，而缺乏O-凝至糖透明酶（O-FUT1）的小鼠像Notch一样催化了Glycan修饰的第一阶段，它们是胎儿致死的。使用从缺乏小鼠建立的ES细胞，研究人员发现，由于O型糖糖糖糖的缺乏，配体结合能力丧失，并且缺乏几乎改变了Notch的细胞表面表达。今年，我们在与表达配体的细胞共培养中进行了缺口信号传导测定，并揭示了缺乏O-羟基聚糖的ES细胞几乎消失了配体依赖性的Notch活化。此外，当RNAi在CHO细胞中击倒O-糖糖转移酶的表达时，对于Notch配体结合和Notch的配体依赖性激活，观察到显着的衰减。为了确认Notch配体结合实验的特异性，在CHO细胞中表达了小鼠Notch1的细胞外区域片段，并从培养基中收集并纯化。该片段以体积依赖性方式抑制了Notch配体与小鼠ES细胞的结合。此外，具有修改的特异性O-糖降解位点的部分完全完全缺陷的Notch1细胞外区域碎片几乎没有抑制Notch配体与小鼠ES细胞的结合。这些结果清楚地表明，Notch细胞外结构域的O-凝至糖糖糖对于配体结合和配体依赖性凹槽的活化至关重要。