セミインタクト細胞系を用いたアグリソーム形成機構の可視化解析

使用半完整细胞系统可视化分析聚集体形成机制

• 批准号: 17028009
• 负责人: 加納 ふみ
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17028009/
• 关键词: 細胞ストレス; 小胞体; 小胞輸送; 可視化; セミインタクト細胞; 小胞体関連分解; プロテアソーム

細胞内コレステロール排出活性を持つABCタンパク質ABCA1の一アミノ酸置換変異体ABCA1-QRは通常は小胞体に留まったままだが、小胞体ストレスに敏感に反応して小胞体を離脱し形質膜へと輸送されることを見出した。実際、ABCA1-QR-GFPを恒常的に発現しているstable transfectant(HEK-QR)に小胞体ストレス(DTT処理又はタプシガルジン処理など)を負荷したところ、小胞体に蓄積していたQR-GFPはおおよそ30分以内で核周縁領域に移行し蓄積する様子が観察された。つまり、小胞体に蓄積しERAD経路を取って分解されていたQR-GFPは、小胞体ストレス負荷により通常の小胞輸送経路を取って細胞形質膜へと輸送されるており、同一の膜タンパク質が小胞体内でERAD経路と小胞輸送経路を選別しうることが明らかとなった。そこで、申請者は小胞体ストレス依存的なQR-GFPの小胞体からの輸送に関わるキナーゼの網羅的同定を試みた。始めに20種類のキナーゼ阻害剤をHEK-QRに作用させた上で小胞体ストレスを負荷し、ジアシルグリセロールキナーゼおよびGSK3beta阻害剤などによって輸送が阻害されることを明らかにした。さらに、阻害剤の結果に基づいて当研究室が保持する細胞チップ自動作成装置を用いて網羅的キナーゼRNAiを行い、数種類のキナーゼが小胞体ストレス依存的なABCA1-QRの輸送に関与することを見つけた。今後はこのキナーゼ群の関与の確認、および詳細な分子メカニズムの同定を行う予定である。

ABCA1-QR是一种一种氨基酸取代突变体ABCA1，具有细胞内胆固醇超排量活性，通常保留在内质网中，但发现从内质网中释放出来，并从内质网中释放到质膜，以对内质网状应激的敏感反应。实际上，当组成性表达ABCA1-QR-GFP的稳定转染剂（HEK-QR）受到压力（例如DTT治疗或thapsigardin治疗）时，QR-GFP在内质网中积累，迁移到外围区域，并在外围区域迁移至大约30分钟。换句话说，在内质网中积累并被Erad途径降解的QR-GFP通过采取正常的囊泡转运途径而被运输到质膜上，并且由于内质网的压力而引起的正常囊泡途径，并且已经表明，同样的膜蛋白可以在擦除途径之间选择返回的路径，并在擦除途径之间进行了返回。因此，申请人试图全面识别参与内质网应激依赖性肾应激的QR-GFP转运的激酶。首先，将20种类型的激酶抑制剂应用于HEK-QR，然后受到内质网应激，并揭示了二酰基甘油激酶和GSK3BETA抑制剂抑制转运。此外，基于抑制剂结果，使用我们实验室持有的自动细胞芯片创建装置进行了全面的激酶RNAi，发现几种类型的激酶参与内质网应激依赖性ABCA1-QR的转运。将来，我们将确认该激酶组的参与并确定详细的分子机制。

项目成果

NSF/SNAPs and p97/p47/VCIP135 are sequentially required for cell cycle-dependent reformation of nthe ER network

NSF/SNAP 和 p97/p47/VCIP135 是 ER 网络的细胞周期依赖性重组所必需的

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes to Cells 10
• 作者: Kano;F.
• 通讯作者: F.

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

• 发表时间: 2005
• 期刊: リボソーム応用の新展開 人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之
• 通讯作者: 村田昌之

セミインタクト細胞を用いた細胞内イベントの可視化解析

使用半完整细胞对细胞内事件进行可视化分析

• 发表时间: 2005
• 期刊: 生物物理 45
• 作者: Kano;F.;山内忍
• 通讯作者: 山内忍