セミインタクト細胞を用いたオルガネラの形態形成とそのダイナミクスの分子機構の解明

使用半完整细胞阐明细胞器形态发生及其动力学的分子机制

• 批准号: 02J03970
• 负责人: 加納 ふみ
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The University of Tokyo (2003)Okazaki National Research Institutes (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J03970/
• 关键词: セミインタクト細胞; GFP; 小胞体; 細胞周期; オルガネラ; 可視化; 再構成; 細胞生物学

哺乳動物細胞の小胞体(endoplasmic reticulum, ER)は、間期では細胞中に広がった連続した網目構造を構築している。この細胞内でつながって一つに連続している小胞体が細胞分裂期にどのような機構で娘細胞へと分配されるかを、小胞体の可視化とその動態追跡により明らかにした。まず、小胞体に局在するシャペロンであるHSP47とGFPの融合タンパク質を恒常的に発現するCHO細胞株(CHO-HSP)を樹立し、小胞体を可視化した。共焦点レーザー顕微鏡観察やFLIP(fluorescence loss in photobleaching)法といった分光学的手法を用いた実験より、小胞体は細胞分裂時でも連続であること、しかしERチューブが部分的に切断されることによりそのダイナミクスが間期のときに比べて増大していることなどがわかった。そこで形質膜を透過性にしたセミインタクト細胞系を用いて、ERに特異的な網目構造を変化させる因子を生化学的に探索する系を確立した。セミインタクト細胞は連鎖球菌毒素ストレプトリシンOをCHO-HSP細胞に作用させ、形質膜に直径約30nmの穴をあけることにより調製した。セミインタクトCHO-HSP細胞にL5178Y細胞により調製した間期/M期細胞質をATP再生系とともに添加した後、ERの形態学的変化を光学顕微鏡観察し、three-way Junction assayによる定量化(ある一定範囲内のERの三つ又構造の数をカウントする方法)を行った。その結果、微小管がノコダゾール処理により破壊されているときに限り、M期細胞質によってERの網目構造が破壊されることなどを明らかにすることができた。また、M期細胞質によるERの網目構造の破壊は、Cdc2キナーゼに依存することもわかった。そのターゲットを探索した結果、homotypicな膜融合を制御するp97のコファクターp47がM期においてCdc2キナーゼによってリン酸化され機能が失われることが重要であることを明らかにした。これらの結果はまとめ、現在論文投稿中である。またM期細胞質によって壊れたERの網目構造は新たに間期細胞質を加えることによって再構築されうることがわかり、その細胞質因子の同定を進めている。

哺乳动物细胞的内质网（ER）创建了一个连续的网络，该网络在相间期间遍布整个细胞。内质网和动态跟踪的可视化揭示了在这些细胞中连接和连续的内质网中如何在细胞分裂阶段分布在子细胞中。首先，建立了局部性网状和GFP的HSP47之间表达融合蛋白的CHO细胞系（CHO-HSP），并在HSP47之间表达了融合蛋白，并可视化了内质网。使用光谱技术（如共聚焦激光显微镜和翻转（光漂白中的荧光丧失）方法）的实验表明，即使在细胞分裂期间，内质网也连续不断，但是与相位相比，ER管的部分严重程度会增加其动力学。因此，建立了一个系统，该系统在生物化学上搜索了使用已通过质膜渗透的半独立细胞系改变了ER的网络结构的因素。通过作用于CHO-HSP细胞上的链球菌毒素链霉素O并在质膜中钻孔，直径约为30 nm，制备了半直体细胞。将L5178细胞制备的相间/M相细胞与ATP再生系统一起添加到半独立性CHO-HSP细胞中后，在光学显微镜下观察到ER的形态变化并使用三向连接测定法进行了定量（一种计数ER Triple-Artipor结构数量的方法）。结果，只有在微管被诺科唑处理破坏时，才有可能澄清ER的网络结构被M期细胞质破坏。还发现，M期细胞质对ER的网络结构的破坏取决于CDC2激酶。在搜索了该目标后，据表明，控制同型膜融合的P97的辅助因子P47在M相中由Cdc2激酶磷酸化并失去其功能，这一点很重要。这些结果总结了，目前在纸上提交。此外，发现可以通过添加新的相间细胞质来重建已被M期细胞质打破的ER的网络结构，并且这些细胞质因子的识别正在进行中。

项目成果

Uchiyama, K.: "VCIP135, a novel essential factor for p97/p47-mediated membrane fusion, is required for Golgi and ER assembly in vivo"Journal of Cell Biology. 159・5. 855-866 (2002)

Uchiyama, K.：“VCIP135 是 p97/p47 介导的膜融合的新型必需因子，是体内高尔基体和 ER 组装所必需的”《细胞生物学杂志》159·5 (2002)。

Uchiyama, K.et al.: "The localization and phosphorylation of p47 are important for Golgi disassembly-assembly during the cell cycle"J.Cell Biol.. 161 6. 1067-1079 (2003)

Uchiyama, K. 等人：“p47 的定位和磷酸化对于细胞周期中高尔基体的分解组装非常重要”J.Cell Biol.. 161 6. 1067-1079 (2003)

Tanaka, AR.: "Effects of Mutations of ABCA1 in the First Extracellular Domain on Subcellular Trafficking and ATP binding/hydrolysis"Journal of Biological Chemistry. 278・10. 8815-8819 (2003)

Tanaka, AR.：“第一胞外结构域中的 ABCA1 突变对亚细胞运输和 ATP 结合/水解的影响”《生物化学杂志》278・10（2003 年）。

Yuasa-Kawada, J.et al.: "Axonal morphogenesis controlled by antagonistic roles of two CRMP subtypes in microtubule organization"Eur.J.Neurosci.. 17 11. 2329-2343 (2003)

Yuasa-Kawada, J.et al.：“微管组织中两种 CRMP 亚型的拮抗作用控制轴突形态发生”Eur.J.Neurosci.. 17 11. 2329-2343 (2003)

Nadanaka, S.et al.: "Activation of Mammalian Unfolded Protein Response Is Compatible with the Quality Control System Operating in the Endoplasmic Reticulum."Mol.Biol.Cell. (In press). (2004)

Nadanaka, S.等人：“哺乳动物未折叠蛋白反应的激活与内质网中运行的质量控制系统兼容。”Mol.Biol.Cell。