Cdk9-サイクリンT複合体による発生・分化制御機構の解析

Cdk9-cyclin T复合物发育和分化控制机制分析

基本信息

批准号：
16026213
负责人：
和田忠士
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ゼブラフィッシュを用いて発生・分化の制御メカニズムをRNAポリメラーゼIIによる転写反応と関連させて分子レベルで解明することを目的としている。これまでに、転写反応を伸長段階で促進する活性で同定されたCdk9-サイクリンT複合体を標的として研究を進め、ゼブラフィッシュCdk9(zCdk9)の機能抑制実験をモルフォリノオリゴヌクレオチド(MO)の微小注入によるアンチセンス法およびCdk9の有するキナーゼ活性を特異的に阻害するフラボピリドールを用いて行った。その結果、いずれの場合もゼブラフィッシュの初期卵割が、受精後3.8時間のドームステージで停止することを見出した。RNAポリメラーゼIIの特異的阻害剤α-アマニチンを受精直後の卵に微小注入した場合、これまでの報告にあるようにドームステージで卵割が停止することを確認した。また、パルスラベル法により受精直後から6時間頃にかけて合成されるRNAを放射性標識し検出した。その結果、ゼブラフィッシュにおいては、受精後2時間から4時間の間に活発にRNA合成が始まることがわかった。さらに、zCdk9に対するMOの注入では、対象と比較してmRNA合成が特異的に阻害されることもわかった。これまでの報告によると、ゼブラフィッシュの中期胞胚遷移(MBT)は、受精後約3時間(10回目の細胞分裂時)に生じる。よって、Cdk9の機能阻害実験で観察される卵割の停止は、MBTで開始されるmRNA合成の阻害と密接に関連することが示唆された。一方、受精直後からMBTにかけてzCdk9のmRNAやタンパク質量を観察したが、それらの劇的な変動は今のところ観察されていない。今後は、MBT前後でのCdk9活性制御メカニズムの検討が必要であると考えられる。

本研究的目的是利用斑马鱼阐明与 RNA 聚合酶 II 转录反应相关的分子水平发育和分化的控制机制。迄今为止，我们一直在针对 Cdk9-cyclin T 复合物进行研究，该复合物已被鉴定具有促进转录反应延伸期的活性，并进行了使用吗啉代寡核苷酸抑制斑马鱼 Cdk9 (zCdk9) 功能的实验(MOs)。使用反义注射法和特异性抑制Cdk9激酶活性的flavopiridol。结果，他们发现在所有情况下，斑马鱼的早期卵裂都停止在圆顶阶段，即受精后 3.8 小时。当 α-鹅膏蕈碱（RNA 聚合酶 II 的特异性抑制剂）在受精后立即显微注射到卵子中时，我们证实了卵裂在圆顶阶段停止，正如之前报道的那样。另外，对受精后至约6小时合成的RNA进行放射性标记，并使用脉冲标记法进行检测。结果表明，在斑马鱼中，RNA 合成在受精后 2 至 4 小时内开始活跃。此外，我们发现与对照相比，注射针对 zCdk9 的 MO 特异性抑制 mRNA 合成。根据之前的报道，斑马鱼的囊胚中期转变（MBT）发生在受精后大约3小时（第10次细胞分裂时）。因此，表明在Cdk9功能抑制实验中观察到的裂解停滞与MBT引发的mRNA合成的抑制密切相关。另一方面，我们观察了从受精后到MBT期间zCdk9的mRNA和蛋白水平，但迄今为止尚未观察到显着的变化。未来有必要研究MBT前后Cdk9活性的控制机制。