環境ホルモン固定化高性能ビーズを用いて同定した生体側レセプターの機能解析

使用内分泌干扰物固定的高性能微珠鉴定生物受体的功能分析

基本信息

批准号：
14042211
负责人：
和田忠士
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

高性能ビーズのラテックス微粒子の表面に、内分泌攪乱物質(Endocrine Disruptors : EDs)に含まれるフタル酸エステル、アルキルフェノール、アトラジンを共有結合を介して固定化し、細胞(子宮頸癌細胞由来HeLa細胞およびヒト乳がん細胞由来MCF7細胞)の粗抽出液からこれらのEDsに特異的に結合する生体側レセプター分子(タンパク質)の精製を試みた。また、精製条件を検討することにより、EDsとそれぞれの結合タンパク質の間の親和性が異なることがわかった。その後、フタル酸エステルとノニルフェノールに高親和性を有するタンパク質を大量に精製し、質量分析計を用いた解析によって部分アミノ酸配列を決定することに成功した。次いで、これらのタンパク質で興味深いものを選択し、対応するcDNAをRT-PCR法により単離し、大腸菌発現ベクターに組み込み、組換えタンパク質の調整を行った。一方、ノニルフェノールに選択的に結合する複数のタンパク質の内の一つは既知タンパク質であり、特異抗体を容易に入手することができた。その特異抗体を用いたウエスタンブロット法により、ノニルフェロールとの結合の親和性に関する解析を行った。さらに、抗エストロゲン受容体抗体を併用しMCF7細胞の粗抽出液で検討したところ、ノニルフェノール固定化高性能ビーズ精製画分にエストロゲン受容体に加え今回新たに同定したタンパク質が同時に検出されることがわかった。以上の結果より、ノニルフェノールの場合は、新たに同定した選択的結合タンパク質がエストロゲン受容体と同時に、あるいは同程度のアフィニティーでノニルフェノールに結合することが示された。このことは、現時点でEDsの生体に及ぼす影響のメカニズムに関する明確な結論が得られていない状況で、EDsのエストロゲン受容体とは異なる新たな生体側受容体の存在を物質レベルで証明できたことで非常に意義深いと考えられる。また、本研究成果は、生体内に未解明のEDs依存的反応が存在することを示唆しており、今後EDsに関する研究に新たな視点を与え、その分子レベルでの解析に貢献するものと考えられる。

我们尝试将内分泌干扰物（ED）中的邻苯二甲酸酯、烷基酚和莠去津通过共价键固定在高性能微珠的乳胶微粒表面，并与细胞（宫颈癌细胞来源的 HeLa 细胞和人乳腺癌细胞）结合。从细胞衍生的 MCF7 细胞的粗提物中纯化与这些 ED 特异性结合的生物受体分子（蛋白质）。此外，通过检查纯化条件，发现ED与每种结合蛋白之间的亲和力不同。然后，他们纯化了大量对邻苯二甲酸酯和壬基酚具有高亲和力的蛋白质，并通过使用质谱仪分析成功确定了部分氨基酸序列。接下来，我们从这些蛋白中筛选出感兴趣的蛋白，通过RT-PCR分离出相应的cDNA，将其插入大肠杆菌表达载体中，并制备重组蛋白。另一方面，选择性结合壬基酚的多种蛋白质中的一种是已知蛋白质，并且可以容易地获得特异性抗体。使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析与壬基酚的结合亲和力。此外，当我们使用抗雌激素受体抗体研究MCF7细胞的粗提物时，我们发现除了壬基酚固定的高性能珠纯化组分中的雌激素受体之外，还同时检测到了新鉴定的蛋白质。上述结果表明，在壬基酚的情况下，新鉴定的选择性结合蛋白与雌激素受体同时或以相同的亲和力结合壬基酚。虽然目前关于EDs对生命体的作用机制还没有得出明确的结论，但这在物质水平上证明了存在一种与EDs雌激素受体不同的新生物受体，这被认为是非常有意义的。此外，这项研究的结果表明，在生物体中存在未探索的EDs依赖性反应，并有望为未来的EDs研究提供新的视角，并有助于其在分子水平上的分析。