ドッキング・サイトを介したストレス応答情報伝達経路の活性化と特異性維持の分子機構

通过对接位点激活应激反应信号通路并维持特异性的分子机制

基本信息

批准号：
16022218
负责人：
舘林和夫
金额：
$ 2.5万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトのp38 MAPキナーゼ経路は、様々な物理化学的ストレスによって活性化されるストレス応答情報伝達経路の一つであるが、アポトーシスの誘導や細胞周期制御にも関与しており、この経路の機能異常が癌などの疾患を引き起こすことが示唆されている。我々はp38経路の活性化の分子機構を明らかにするため、p38経路のMKK6 MAPKKにおけるMAPKKK(MTK1、ASK1)との特異的ドッキング・サイトをtwo-hybrid法により探索した。キナーゼ・ドメインの外側に位置するC末端のわずか20アミノ酸をMKK6から欠失させたところ、MTK1、ASK1のいずれのキナーゼ・ドメインとも結合がみられなくなった。そこでMTK1及びASK1との結合に重要なアミノ酸残基を調べるために、MKK6のC末端領域を4アミノ酸ずつ系統的にアラニンで置換して、two-hybrid法によってMTK1、ASK1に対する結合能を調べた。その結果、MKK6のC末端28アミノ酸(a.a.307-334)がドッキング・サイトとしてMTK1、ASK1との結合に関与することがわかった。この領域はαヘリックスの形成が予測され、ミスセンス変異による解析からV324、F327、V328、I331のアミノ酸が結合に重要であることがわかった。またドッキング・サイト変異型MKK6に結合できるようになったMTK1の抑圧変異として、Q1352R、K1371E、G1424Vを単離した。いずれもMTK1キナーゼ・ドメインのNローブ内の変異であり、NローブでのMKK6との結合が示唆された。これまで不明であった動物細胞MAPKKのMAPKKKドッキング・サイトを本研究において新たに発見できたことは、今後のp38経路の活性化、シグナル特異性決定の機構解明に大きく貢献すると考えられた。

人p38 MAP激酶途径是通过各种物理化学应力激活的应力响应信息传递途径之一，但也参与诱导凋亡和细胞周期调节，表明该途径中的异常会导致癌症等疾病。为了阐明p38途径激活的分子机制，我们通过两种杂交方法在p38途径的mkk6 mapkk中搜索了用mapkkk（mtk1，ask1）的特定对接位点。当从MKK6中删除位于激酶结构域外的C末端的20个氨基酸时，不再观察到与MTK1或Ask1激酶结构域的结合。因此，为了研究与MTK1和ASK1结合重要的氨基酸残基，将MKK6的C末端区域系统替换为四个氨基酸的丙氨酸，并通过两种杂交方法检查了MTK1和ASK1的结合能力。结果表明，MKK6的C末端28氨基酸（A.A.307-334）与MTK1和Ask1作为对接位点有关。该区域预测了α-螺旋的形成，而错过突变的分析表明，氨基酸V324，F327，V328和I331对于结合很重要。 Q1352R，K1371E和G1424V也被分离为MTK1的抑制突变，该突变能够与对接位点突变体MKK6结合。两者都是MTK1激酶结构域N-室内的突变，表明N-LOBE中的MKK6结合。在这项研究中，发现动物细胞MAPKK的先前未知的MAPKK对接位点被认为是阐明未来信号特异性确定机制的主要原因。