高浸透圧のキナーゼ反応増強作用による環境ストレス応答の新奇制御機構

高渗激酶反应增强效应调节环境应激反应的新机制

基本信息

批准号：
21H02422
负责人：
舘林和夫
金额：
$ 11.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路の高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みを解析した。リン酸化増強の作用点として1)Pbs2-Hog1リン酸化、2) Ssk2-Pbs2リン酸化が存在するが、Pbs2は酵素、基質の両方の役割を持つ。さらに高浸透圧によるリン酸化増強は、特にPbs2の活性化ループ内のSer514（S514）、Thr518（T518）の一方のみがリン酸化されたモノリン酸化Pbs2によるHog1のリン酸化に必要であることから、リン酸化増強作用を理解する上で、同ループのリン酸化制御機構の解明が重要である。そこで未知だったPbs2の活性化ループの脱リン酸化機構を解析した。特異的リン酸化抗体及びPhos-tagバンドシフトアッセイ法を組み合わせてS514、T518のリン酸化を直接検出する系を初めて確立し、Hog1経路を負に制御する2C型ホスファターゼ群の欠失変異がPbs2脱リン酸化に与える影響を調べた。その結果、主としてPtc1がT518の脱リン酸化に働くこと、Ptc1、Ptc2、Ptc3、Ptc4がS514の脱リン酸化に重複して働くことがわかった。また高浸透圧刺激下でPbs2のS514、T518の両者をリン酸化するSsk2は、活性の弱い非刺激時にはT518のみしかリン酸化できないことを示し、高浸透圧増強の起こらない非刺激時において不適切なHog1のリン酸化・活性化が抑制される仕組みを明らかにした。上記に加えて、リン酸化増強を模倣する可能性のあるPbs2の超活性型変異体を単離・解析した結果、それらが基質としての性質変化を示唆する活性化ループ内のリン酸化が亢進するタイプの変異であることがわかった。さらにSsk2のリン酸化活性に重要な自己リン酸化候補部位を同定した。

在这项研究中，我们分析了由于高渗透反应HOG1 MAPK途径在酵母中高渗透压HOG1 MAPK途径中，细胞质局部激酶的磷酸化增强效应的机制。虽然1）PBS2-HOG1磷酸化和2）SSK2-PBS2磷酸化是磷酸化增强的作用点，PBS2既扮演酶和底物。 Furthermore, since the phosphorylation enhancement by high osmotic pressure is required, especially since only one of Ser514 (S514) and Thr518 (T518) within the Pbs2 activation loop is required for phosphorylation of Hog1 by phosphorylated monophosphorylated Pbs2, it is important to understand the phosphorylation control mechanism of the loop in order to understand the phosphorylation enhancement 影响。因此，我们分析了PBS2激活环的未知去磷酸化机理。我们已经建立了第一个系统，该系统直接通过结合特定的磷酸化抗体和Phos-TAG带轮移分析来检测S514和T518的磷酸化，并研究了2C磷酸酶组中缺失突变的效果，从而负面调节HOG1途径对PBS2途径对PBS2 dephosphosphosphosphosphosphorpation的影响。结果表明，PTC1主要作用于T518的去磷酸化，而PTC1，PTC2，PTC3和PTC4与S514的去磷酸化重叠。此外，SSK2在高渗透刺激下磷酸化PBS2的S514和T518均表明，在非刺激过程中只能磷酸化T518，其活性较弱，揭示了一种机制，从而揭示了Hog1不适当的磷酸化和激活，而Hog1的激活并未抑制，而高渗透压力不会增加。除上述外，分离和分析了可能模仿磷酸化增强的PBS2的超活性突变体，发现它们是促进激活环内磷酸化的突变类型，表明在底物中的性质变化。此外，我们确定了一个候选自磷酸化位点，该位点对于SSK2的磷酸化活性很重要。