高浸透圧のキナーゼ反応増強作用による環境ストレス応答の新奇制御機構

高渗激酶反应增强效应调节环境应激反应的新机制

基本信息

批准号：
21H02422
负责人：
舘林和夫
金额：
$ 11.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路の高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みを解析した。リン酸化増強の作用点として1)Pbs2-Hog1リン酸化、2) Ssk2-Pbs2リン酸化が存在するが、Pbs2は酵素、基質の両方の役割を持つ。さらに高浸透圧によるリン酸化増強は、特にPbs2の活性化ループ内のSer514（S514）、Thr518（T518）の一方のみがリン酸化されたモノリン酸化Pbs2によるHog1のリン酸化に必要であることから、リン酸化増強作用を理解する上で、同ループのリン酸化制御機構の解明が重要である。そこで未知だったPbs2の活性化ループの脱リン酸化機構を解析した。特異的リン酸化抗体及びPhos-tagバンドシフトアッセイ法を組み合わせてS514、T518のリン酸化を直接検出する系を初めて確立し、Hog1経路を負に制御する2C型ホスファターゼ群の欠失変異がPbs2脱リン酸化に与える影響を調べた。その結果、主としてPtc1がT518の脱リン酸化に働くこと、Ptc1、Ptc2、Ptc3、Ptc4がS514の脱リン酸化に重複して働くことがわかった。また高浸透圧刺激下でPbs2のS514、T518の両者をリン酸化するSsk2は、活性の弱い非刺激時にはT518のみしかリン酸化できないことを示し、高浸透圧増強の起こらない非刺激時において不適切なHog1のリン酸化・活性化が抑制される仕組みを明らかにした。上記に加えて、リン酸化増強を模倣する可能性のあるPbs2の超活性型変異体を単離・解析した結果、それらが基質としての性質変化を示唆する活性化ループ内のリン酸化が亢進するタイプの変異であることがわかった。さらにSsk2のリン酸化活性に重要な自己リン酸化候補部位を同定した。

在本研究中，我们分析了高渗压增强酵母高渗响应 Hog1 MAPK 通路中细胞质激酶磷酸化的机制。 1)Pbs2-Hog1磷酸化和2)Ssk2-Pbs2磷酸化作为磷酸化增强的作用点而存在，Pbs2同时具有酶和底物的作用。此外，高渗透压导致的磷酸化增强对于单磷酸化Pbs2对Hog1的磷酸化是必要的，其中Pbs2激活环中仅Ser514（S514）和Thr518（T518）之一被磷酸化。由于磷酸化增强作用，阐明该环的磷酸化控制机制非常重要。因此，我们分析了之前未知的Pbs2激活环的去磷酸化机制。我们首次建立了结合特异性磷酸化抗体和Phos-tag带位移分析直接检测S514和T518磷酸化的系统，并发现负调节Hog1途径的2C型磷酸酶的缺失突变与Pbs2相关研究了对磷酸化的影响。结果发现，Ptc1主要作用于T518的去磷酸化，而Ptc1、Ptc2、Ptc3和Ptc4冗余地作用于S514的去磷酸化。此外，在高渗刺激下磷酸化Pbs2的S514和T518的Ssk2只能在未刺激时磷酸化T518，此时其活性较弱，并且在不发生高渗增强的未刺激条件下是不合适的。我们阐明了Hog1的机制。磷酸化和激活被抑制。除此之外，我们还分离并分析了可能模拟增强磷酸化的 Pbs2 超活性突变体，发现激活环内的磷酸化增加，表明它们作为底物的特性发生了改变。此外，我们还确定了对 Ssk2 磷酸化活性很重要的候选自磷酸化位点。