ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

开发高效的基因打靶系统，用于人类基因的系统功能分析

基本信息

批准号：
16012252
负责人：
小山秀機
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。

由于靶向效率较低，很难通过基因靶向基因靶向产生敲除菌株。最近，我们发现来自人类前B-胞瘤的NALM-6菌株具有较高的靶向效率。因此，本研究旨在使用NALM-6菌株开发高效的靶向系统，以将其应用于人类基因的系统功能分析。今年，准备了常染色体基因突变和有丝分裂的重组系统，并产生了必需生长基因的有条件致命突变体。结果，（1）对10个不同的基因座进行靶向，并以2-10％的高效率获得目标克隆。因此，已经证实NALM-6细胞是能够高效靶向的菌株。（2）靶向位于16染色体上的APRT基因以获得异质分解（APRT +/-）菌株。使用这种菌株，几乎创建了一个波动测试系统，以检测具有对8-唑济氨酸的抗性（APRT - / - ）细胞中的自发突变。（3）为突变基因的结构分析，制备了能够扩增APRT基因区域的PCR分析系统。我们还找到了一个可以连接到APRT基因座并鉴定同源染色体的迷你卫星标记。（4）另一方面，进行靶向以获得ku70基因的缺失应变，该基因可用于DNA双链断裂修复和端粒维护，以获得异力菌株。接下来，进行第二个靶向，但没有获得同型突变，而KU70被认为对于生长和生存至关重要。（5）因此，为了使用TET控制系统将应变作为条件致死应变，首先将TET载体引入到异源菌株中。接下来，引入了TET反应性人Ku70 cDNA载体，并分离了DOX可以控制的菌株。该菌株受到ku70靶向的靶向，但未获得目标克隆，并正在研究进一步的分离方法。