ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

开发高效的基因打靶系统，用于人类基因的系统功能分析

基本信息

批准号：
16012252
负责人：
小山秀機
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。

由于靶向效率低，通过基因靶向从人类细胞中创建敲除菌株很困难。最近，我们发现人类前B细胞肿瘤来源的Nalm-6菌株具有很高的靶向效率。因此，本研究的目的是利用Nalm-6菌株开发高效的靶向系统，用于人类基因的系统功能分析。今年，我们创建了常染色体基因突变/有丝分裂重组系统和增殖必需基因的条件致死突变株。结果，（1）靶向10个不同基因位点，获得目标克隆，效率高达2-10%。因此，我们证实Nalm-6细胞是一种能够高效靶向的细胞系。 (2)我们靶向位于16号染色体上的APRT基因，获得了杂合子(APRT+/-)菌株。使用该菌株，我们几乎创建了一个波动测试系统，可以检测 8-氮杂腺嘌呤抗性纯合 (APRT-/-) 细胞中的自发突变。 (3)为了分析突变基因的结构，我们创建了可以扩增APRT基因区域的PCR分析系统。我们还发现了一个与 APRT 基因座连锁的小卫星标记，可以识别同源染色体。 (4)另一方面，我们进行靶向获得缺失KU70基因的菌株，该基因在DNA双链断裂修复和端粒维持中发挥作用，获得杂合突变菌株。随后进行了第二次靶向尝试，但没有获得纯合突变体，这表明 KU70 对于增殖和存活至关重要。 (5)因此，为了使用Tet控制系统分离条件致死菌株，我们首先将Tet载体引入杂合突变菌株中。接下来，我们引入了Tet响应的人KU70 cDNA载体，并分离了其表达可以受DOX控制的菌株。虽然我们对该菌株进行了KU70靶向，但无法获得目标克隆，目前正在考虑进一步的分离方法。