哺乳類細胞の組換えにおけるトポイソメラーゼの関与

拓扑异构酶参与哺乳动物细胞的重组

基本信息

批准号：
06680694
负责人：
小山秀機
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、動物細胞の組換えにおけるトポイソメラーゼの関与を検討している。一昨年、CHO/APRT^-細胞にaprt遺伝子由来ベクターを導入した後、トポイソメラーゼII(topII)阻害剤で処理すると、ベクターの相同および非相同的組換えが促進される現象を見いだした。topII阻害剤には、作用の異なる3種類の薬剤が知られている。当初、VP-16とICRF-193を用いたが、今回m-AMSAで同様の効果を見いだし、促進現象がtopIIの阻害によることが明らかにした。今回、遺伝子治療への可能性を追求するため、ヒト奇形腫細胞株PA-1を細胞モデルに用いて、再検討を行った。その結果、この細胞系でも3種のtopII阻害剤で、より高い非相同組換えの促進を見いだした。特に、pSV2CATを導入しtopII阻害剤で処理したが、阻害剤処理と未処理でCATの発現量に差がなかった。この結果から、核内に取り込まれたベクターの量に差がないが、ベクターが染色体へ組込まれるステップにtopII阻害剤が作用していることが示唆される。現在、染色体に組込まれたベクターの構造、特にゲノムとベクターの接続点を解析し、topIIの認識配列との関連を調べつつある。topIIにはαとβのアイソフォームが存在する。2種のフォームの組換えおよび細胞周期における役割を直接解析するため、ジーンターゲティングにより遺伝子破壊を試みた。まず、クローン化したマウスtopIIα遺伝子を用いてターゲティングベクターを作成して、マウスES細胞に導入し、ターゲットされたクローンのスクリーニングを行っている。

我们正在研究拓扑异构酶在动物细胞重组中的参与。两年前，我们发现将 aprt 基因衍生的载体引入 CHO/APRT^- 细胞后，用拓扑异构酶 II (topII) 抑制剂处理可促进载体的同源和非同源重组。已知三种类型的topII抑制剂具有不同的作用。最初，我们使用VP-16和ICRF-193，但现在我们发现与m-AMSA类似的效果，揭示了促进现象是由于topII的抑制所致。这次，为了追寻基因治疗的可能性，我们重新审视了人畸胎瘤细胞系PA-1作为细胞模型。结果，我们发现三种类型的topII抑制剂在该细胞系中也更高程度地促进非同源重组。特别是，当引入pSV2CAT并用topII抑制剂处理时，抑制剂处理的细胞和未处理的细胞之间CAT的表达水平没有差异。该结果表明，虽然进入细胞核的载体的量没有差异，但是topII抑制剂作用于载体整合到染色体中的步骤。我们目前正在分析整合到染色体中的载体的结构，特别是基因组与载体的连接点，并研究与topII识别序列的关系。 topII 具有 α 和 β 亚型。为了直接分析这两种形式在重组和细胞周期中的作用，我们尝试通过基因打靶来破坏基因。首先，使用克隆的小鼠topIIα基因创建靶向载体，将其导入小鼠ES细胞中，并筛选靶向克隆。