ヒトプレB細胞よりBLM破壊株の作製とそ非相同的末端連結能の解析

从人前 B 细胞中生成 BLM 破坏的菌株并分析其非同源末端连接能力

基本信息

批准号：
15023249
负责人：
小山秀機
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高発がん性の遺伝病ブルーム症候群(BS)は、高頻度の姉妹染色体交換とともに欠失、転座などの染色体異常を示す。従来、この染色体異常を引き起こし発がんの原因となる可能性の高いエラープローンの非相同的末端連結(NHEJ)の解析はわずかしか報告がない。最近、我々はヒトプレB細胞Nalm-6およびNalm-6由来でNHEJに必須のDNAリガーゼIV(LIG4)欠損株から、ジーンターゲティングによりBLM破壊株と2重破壊株を取得した。本研究は、これら破壊株を用いて染色体上におけるNHEJ能を解析し、BSの高発がん性の原因とメカニズムを明らかにすることを目的として行い、以下の結果を得た。(1)各細胞株のNHEJ能を解析するため、hprt遺伝子座にSceI部位を組み込んだ株を作製した。この各株にpSceIベクターを導入し生き残ったクローン中でSceI部位の消失クローンを選択、PCRで連結部位を増幅し塩基配列を決定した。この方法により各株のNHEJ修復頻度と連結部位の構造を調べ、BLM破壊株は野生株とほぼ同じ頻度とサイズの欠失を示し、BLM破壊株でNHEJがほぼ正常に機能していることを見出した。一方、LIG4破壊株は高い頻度とより大きな欠失を示し、2重破壊株はそれがより顕著であった。一方、各破壊株の表現型を解析すると、(2)BLM破壊株の増殖能の大幅な低下、(3)姉妹染色体交換頻度の増大、(4)hprt座における突然変異頻度の増大、(5)DNA傷害剤MMS、HU、UVに高感受性を示した。しかし、(6)BLMとLIG4の2重破壊株において、増殖能、突然変異頻度、DNA傷害剤感受性がLIG4欠損により抑制されるという興味深い結果を得た。(7)Ku70遺伝子のヘテロ破壊株を作製できたが完全破壊株が得られず、Ku70が生存に必須の可能性がある。そこで、条件致死破壊株として作製を試みている。

高度致癌的遗传疾病Bloom综合征（BS）表现出染色体异常，例如缺失和易位以及姊妹染色体交换的高频。过去，只有少数报道可以分析错误prones的非同源末端连接（NHEJ），这些终端结扎率很可能导致这种染色体异常并引起癌症。最近，我们通过DNA连接酶IV（Lig4）缺陷菌株的基因靶向获得了BLM和双重破坏性菌株，这对于NHEJ至关重要，来自人类前B细胞NALM-6和NALM-6。使用这些破坏菌株进行了这项研究，以分析NHEJ对染色体的能力，并阐明BS高度致癌性的原因和机制，并获得了以下结果。（1）为了分析每个细胞系的NHEJ电势，制备了将SCEI位点纳入HPRT基因座的应变。将PSCEI载体引入了每个菌株中，并且在幸存的克隆中选择了丢失SCEI位点的克隆，并通过PCR扩增连接位点以确定基本序列。该方法研究了每个菌株中NHEJ修复频率和连锁位点的结构，发现BLM中断的应变表现出与野生应变大致相同的频率和大小的删除，并且NHEJ在BLM中的菌株中几乎正常工作。另一方面，LIG4破坏菌株显示出更高的频率和更大的缺失，并且双重破坏菌株更为明显。另一方面，在分析每个干扰应变的表型时，表明（2）BLM菌株的增殖能力显着降低，（（3）姊妹染色体交换的频率增加，（4）HPRT轨迹在HPRT轨迹的突变频率的增加，以及（5）（5）（5）DNA照射的dna hisdentes and Mms和MMS，Hu和UV。但是，（6）我们获得了有趣的结果，即通过双层损害菌株的BLM和Lig4的Lig4缺乏抑制了增殖能力，突变频率和DNA损伤敏感性。（7）产生了Ku70基因的异偶联应力，但没有获得完全破坏性菌株，KU70对于生存可能是必不可少的。因此，我们试图将其作为有条件的致命破坏性菌株产生。