ヒトプレB細胞よりBLM破壊株の作製とそ非相同的末端連結能の解析

从人前 B 细胞中生成 BLM 破坏的菌株并分析其非同源末端连接能力

基本信息

批准号：
15023249
负责人：
小山秀機
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高発がん性の遺伝病ブルーム症候群(BS)は、高頻度の姉妹染色体交換とともに欠失、転座などの染色体異常を示す。従来、この染色体異常を引き起こし発がんの原因となる可能性の高いエラープローンの非相同的末端連結(NHEJ)の解析はわずかしか報告がない。最近、我々はヒトプレB細胞Nalm-6およびNalm-6由来でNHEJに必須のDNAリガーゼIV(LIG4)欠損株から、ジーンターゲティングによりBLM破壊株と2重破壊株を取得した。本研究は、これら破壊株を用いて染色体上におけるNHEJ能を解析し、BSの高発がん性の原因とメカニズムを明らかにすることを目的として行い、以下の結果を得た。(1)各細胞株のNHEJ能を解析するため、hprt遺伝子座にSceI部位を組み込んだ株を作製した。この各株にpSceIベクターを導入し生き残ったクローン中でSceI部位の消失クローンを選択、PCRで連結部位を増幅し塩基配列を決定した。この方法により各株のNHEJ修復頻度と連結部位の構造を調べ、BLM破壊株は野生株とほぼ同じ頻度とサイズの欠失を示し、BLM破壊株でNHEJがほぼ正常に機能していることを見出した。一方、LIG4破壊株は高い頻度とより大きな欠失を示し、2重破壊株はそれがより顕著であった。一方、各破壊株の表現型を解析すると、(2)BLM破壊株の増殖能の大幅な低下、(3)姉妹染色体交換頻度の増大、(4)hprt座における突然変異頻度の増大、(5)DNA傷害剤MMS、HU、UVに高感受性を示した。しかし、(6)BLMとLIG4の2重破壊株において、増殖能、突然変異頻度、DNA傷害剤感受性がLIG4欠損により抑制されるという興味深い結果を得た。(7)Ku70遺伝子のヘテロ破壊株を作製できたが完全破壊株が得られず、Ku70が生存に必須の可能性がある。そこで、条件致死破壊株として作製を試みている。

布卢姆综合征（BS）是一种高度致癌的遗传病，表现出染色体异常，例如缺失和易位以及频繁的姐妹染色体交换。迄今为止，关于易错非同源末端连接（NHEJ）的分析的报道很少，这种连接极有可能导致染色体异常并导致癌变。最近，我们通过基因打靶从人前 B 细胞 Nalm-6 和 NHEJ 必需的 Nalm-6 衍生的 DNA 连接酶 IV (LIG4) 缺陷菌株中获得了 BLM 破坏菌株和双破坏菌株。本研究利用这些被破坏的菌株来分析染色体上的NHEJ能力，并阐明BS高致癌性的原因和机制，并获得以下结果。 (1)为了分析每个细胞系的NHEJ能力，我们创建了在hprt基因位点插入SceI位点的细胞系。将pSceI载体导入这些菌株中，在存活的克隆中选择SceI位点消失的克隆，通过PCR扩增连接位点，测定碱基序列。使用这种方法，我们研究了每个菌株中 NHEJ 修复的频率和连接位点的结构，发现 BLM 破坏的菌株显示出与野生型菌株大致相同的频率和大小的缺失，表明 NHEJ 是我发现它在 BLM 破坏的菌株中几乎正常工作。另一方面，LIG4破坏的菌株表现出更高的频率和更大的缺失，并且双破坏的菌株表现出更明显的缺失。另一方面，当分析每个破坏菌株的表型时，（2）BLM破坏菌株的生长能力显着下降，（3）姐妹染色体交换频率增加，（4） hprt 位点的突变频率，(5) ) 它对 DNA 损伤剂 MMS、HU 和 UV 显示出高度敏感性。然而，我们获得了有趣的结果：(6) 在 BLM 和 LIG4 双破坏菌株中，LIG4 缺失抑制了增殖能力、突变频率和对 DNA 损伤剂的敏感性。 (7)虽然我们能够创建Ku70基因的杂合突变体，但我们无法获得完整的突变体，这表明Ku70可能对于生存至关重要。因此，我们正在尝试创造一种有条件致死的菌株。