異常蛋白質が引き起こす空胞形成の分子解析

异常蛋白质引起的空泡形成的分子分析

基本信息

批准号：
14037232
负责人：
堀清次
金额：
$ 51.01万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037232/
关键词：
ポリグルタミン VCP p97 AAA ATPase フォルディング腺ガン出芽酵母 polyglutamine CFTR ER stress ubiquitin Lewy body parkinson's disease Alzheimer's disease

项目摘要

(1)VCP及びそのコファクター類の組織分布を免疫組織染色により解析した。マウスでは、管腔構造をとる上皮系の細胞や免疫系細胞、乳腺上皮細胞、胃酸分泌細胞などの分泌機能をもつ細胞で、VCPの強い発現が見られた。ヒト組織でも上皮系の細胞に強い発現が見られ、脂肪肝に伴う細胞内油滴およびMallory bodyの形成部位でも顕著な発現が検出された。また、ヒトがん組織では上皮系の形態をとる細胞で強く発現していた。これらの結果から、VCPはタンパク質や酸などの分泌でも重要な役割を果たしていることが示唆された。(2)HeLa細胞のVCPを5%未満に低下させるsiRNAを作成した。この系にsiRNAの標的とはならないようにデザインした変異体を再導入してタンパク質を置換する普遍的手法を確立し、次の2つの系でVCPあるいはその修飾型が重要な役割を果たしていることを見出した。(2)-1 HeLa細胞ではVCPのノックダウンにより紡錘体極の数が不安定になり、M期で細胞周期が停止もしくは細胞死に至った。野生型VCPの導入で細胞の増殖は回復し、特定部位のリン酸化を模倣する変異体の導入では増殖が更に活性化した。抗体による染色から、このリン酸化VCPは紡錘体極やセントロソームでタンパク質の会合と分離に寄与していることが示唆された。(2)-2 培養細胞に発現させたルシフェラーゼを熱ショックにより変性させると、VCPのノックダウン細胞では活性の回復が遅れた。野生型の導入では活性は回復したが、D1領域のATPase欠失変異体では回復が見られなかった。変性蛋白質の機能回復におけるD1領域ATPase活性の重要性が明らかとなった。(3)VCPが関与する信号伝達経路を解明するため、VCPの発現に依存して生育する温度感受性株を得た。ゲノムライブラリーのスクリーニングにより、温度感受性を回復させる8つの遺伝子断片を得た。

（1）通过免疫组织化学染色分析VCP及其辅助因子的组织分布。在小鼠中，在具有分泌功能的细胞中观察到了VCP的强表达，例如具有腔内结构，免疫系统细胞，乳腺上皮细胞和胃酸分泌细胞的上皮细胞。在上皮细胞中的人体组织中还观察到了强表达，并且在细胞内油滴的部位检测到明显的表达，并因脂肪肝而形成马洛里体。此外，在人类癌组织中，它在采用上皮形态的细胞中强烈表达。这些结果表明，VCP在蛋白质和酸的分泌中也起着重要作用。（2）创建了将HeLa细胞中VCP降低到5％的siRNA。我们通过重新引入旨在不成为siRNA的突变体来替代蛋白质的通用方法，并发现VCP或其修饰的形式在以下两个系统中起着重要作用。（2）-1在HeLa细胞中，VCP的敲低导致主轴杆的数量不稳定，从而导致细胞周期停滞或M期细胞死亡。引入野生型VCP恢复了细胞增殖，并引入了模仿特定部位的磷酸化的突变体进一步激活了增殖。抗体染色表明，这种磷酸化的VCP有助于蛋白质的关联和纺锤形和中心体的分离。（2）-2当在培养细胞中表达的荧光素酶通过热休克变性时，在VCP敲低细胞中延迟了活性的恢复。引入野生型时，该活性恢复了，但是在D1区域的ATPase缺失突变体中未观察到恢复。 D1区域ATPase活性在恢复变性蛋白的功能恢复中的重要性已揭示。（3）为了阐明涉及VCP的信号传导途径，我们获得了一种温度敏感性菌株，该菌株根据VCP的表达而生长。筛选基因组文库导致八个基因片段恢复了温度灵敏度。