ポリグルタミンによる凝集体形成に関与する因子p97/VCPの機能解析

p97/VCP（参与聚谷氨酰胺诱导聚集体形成的因子）的功能分析

基本信息

批准号：
02J01177
负责人：
小林妙子
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は遺伝性ポリグルタミン病の一つMachado-Joseph病の病因タンパク質と相互作用する因子としてAAA ATPaseファミリーに属するp97/VCPを同定した。私は、ATPase活性を消失させたVCPの点変異体(K524A)が激しく空胞化を伴う細胞死を誘導すること、K524A変異体によって誘導される空胞は、異常に拡張した小胞体(ER)であり、ERストレス応答を伴うことを明らかにしてきた。今年度は、VCPが、神経変性疾患の病変部位に観察される凝集タンパク質(凝集体)と共局在する特徴を持つことから、「何故VCPは凝集体と共局在するのか」という疑問にとりくんだ。「VCPは凝集体を認識し、解体処理する機能を持つ」という可能性に着目して、培養細胞を用いた継続的な顕微鏡観察によるVCPの動態解析を行った結果、VCPは凝集体形成時に巻き込まれるのではなく、既にできあがった凝集体を感知して集まること、凝集体の解体時にもVCPは常に凝集体と共局在し続けることを見いだした。さらに、RNAiを用いたVCPのノックダウンを行い、細胞内でVCPが凝集したタンパク質の分解処理に関与していることを明らかにした。また、ドミナントネガティブ変異体(K524A)を用いても同様の結果が得られた。凝集体に対するVCPの機能をより詳細に調べるために、VCPをノックダウンした細胞に野生型VCPあるいはATPase欠損変異体VCPを入れ戻す実験系を確立し、その結果、VCPのATPase活性は、凝集タンパク質の「解きほぐし」の段階に必須であることを証明した。すなわち、VCPが細胞内の異常蛋白質を認識するセンサーとしての能力と、凝集体を解体・処理するシャペロン様の能力を共に有することを明らかにすることができた。

我们确定属于AAA ATPase家族的P97/VCP是与Machado-Joseph氏病的致病蛋白相互作用的因素，Machado-Joseph病是遗传性聚谷氨酰胺疾病之一。我已经表明，失去ATPase活性的VCP点突变体（K524a）会以强烈的空泡诱导细胞死亡，而K524A突变体诱导的液泡是一种异常膨胀的内质网（ER），并具有ER应力反应。今年，我们一直在问一个问题：“为什么VCP与聚集体共定位？”因为VCP具有与神经退行性疾病病变部位观察到的聚集体（聚集体）共定位的特征。我们专注于“ VCP具有识别和拆除聚集体的能力”的可能性，我们使用培养的细胞对VCP进行了连续的微观观察，并发现VCP并未在聚集体的形成中被抓住，而是在骨料的形成中，而是在吸引并收集已经整理的聚集物，并且在vcps中始终会与聚集体的聚集体差异化，即使在聚集体中也偏离了聚集体的成分。此外，使用RNAi将VCP击倒，表明VCP参与了在细胞中聚集的蛋白质的降解。也使用显性负突变体（K524a）获得了相似的结果。为了更详细地研究VCP对聚集体的功能，我们建立了一个实验系统，在该系统中，野生型VCP或ATPase缺陷型突变体VCP被添加到击倒VCP的细胞中，结果，我们证明了VCP的ATPase ATPase ATPase VCP对于“分散分散分散蛋白的分心”阶段至关重要。换句话说，有可能澄清VCP既具有识别细胞内异常蛋白质的能力，又具有拆除和过程聚集体的能力。