単離細胞を用いたヒト消化管自然免疫機能に関わる分子基盤の解析

利用分离细胞分析人类胃肠道先天免疫功能的分子基础

基本信息

批准号：
14021005
负责人：
綾部時芳
金额：
$ 3.01万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14021005/
关键词：
自然免疫内因性抗菌ペプチドパネート細胞 Toll様受容体 defensin 消化管

项目摘要

小腸粘膜上皮の機能的単位である絨毛・陰窩軸(villus-crypt axis)を構成する上皮細胞における自然免疫機構の分子基盤と機能を解明するために,われわれがex vivo細菌感染により内因性抗菌ペプチドを含む顆粒を分泌することを明らかにした小腸パネート細胞(Paneth cell)における病原体認識機構であるToll様受容体(TLR)およびその関連遺伝子の発現を解析した。インフォームド・コンセントの下に,正常ヒト小腸粘膜からわれわれの既報により単離小腸陰窩および,さらに単離小腸陰窩から単離細胞分画を得た。単一の小腸陰窩レベルおよび単一の小腸粘膜上皮細胞レベルでTLR遺伝子および関連遺伝子の発現を,nest PCR法を併用したRT-PCR法で検討した。位相差顕微鏡観察下で,コントラストの強い粗大な分泌顆粒に富む単離パネート細胞は他の細胞群と容易に判別可能であった。単離小腸陰窩において,TLRおよびコレセプターmRNAの発現を認めた。さらに,単離パネート細胞での検討を行い,同様の結果を得た。次に,共焦点レーザー顕微鏡を用いて,単離小腸陰窩および単離細胞におけるTLRの免疫局在を検討した。TLRは陰窩の最基底部のみに局在が認められた。パネート細胞特異的マーカーであるalpha-defensin (HD5)との免疫二重染色により,TLRのパネート細胞における発現が示唆された。また,パネート細胞における局在を検討した。さらに,われわれの確立したex vivo細菌曝露によるヒト小腸パネート細胞分泌系を用いてdefensin-sensitive S. typhimuriumに対する抗菌活性アッセイを行い,パネート細胞上のTLRの機能を解析した。それらの結果,TLRがS. typhimurium刺激によるパネート細胞からのalpha-defensin分泌に関与する可能性を示した。本研究により,ヒトにおける消化管粘膜上皮細胞と微生物の直接的相互作用を明らかにした。

为了阐明构成绒毛丝网轴的上皮细胞中先天免疫机制的分子基础和功能，这是小肠粘膜上皮的功能单位，我们分析了Toll样受体（TLR）的表达（TLR）的表达（TLR），这是一种在Paneth细胞中的病原体识别机制，这些污染物均散发出granial granite defive nogent of defive nogente nefore granite defive nogen exenent of defive nogent of defive nogen exenenity nogen exenenity decente nogen exenenity nogen nogent of。细菌感染及其相关基因。根据知情同意，我们先前的报告从正常的人类小肠粘膜中获得了分离的小肠道隐窝，此外，从分离的小肠道隐窝中获得了孤立的小肠道隐窝。 TLR基因和相关基因在单个小肠道隐窝水平以及在单个小肠粘膜上皮细胞水平上的表达通过RT-PCR方法与Nest PCR方法一起研究。在相对的显微镜下，富含粗分泌的颗粒具有强对比度的孤立的泛酸细胞可以很容易地与其他细胞组区分开。在分离的小肠密隐窝中观察到TLR和共肽mRNA的表达。此外，通过对孤立的摇齿细胞进行研究，获得了相似的结果。接下来，使用共聚焦激光显微镜研究了TLR在分离的小肠密隐窝中的免疫定位和分离的细胞。 TLR仅位于地下室的最大部分。用潘妮特细胞特异性标记α-防御素（HD5）的免疫双重染色表明TLR在Paneto细胞中的表达。此外，研究了泛细胞中的定位。此外，我们使用我们已建立的人类小肠道泛酸细胞分泌系统对防御素敏感的伤寒链霉菌进行了抗菌活性测定，该分析是通过体内细菌暴露来分析TLR在泛细胞上的功能。这些结果表明，TLR可能通过鼠伤寒链球菌刺激参与了帕内托细胞的α-防御素分泌。这项研究揭示了胃肠道上皮细胞与人类微生物之间的直接相互作用。