真核生物複製フォークの染色体複製およびゲノム安定性維持における役割

真核复制叉在染色体复制和基因组稳定性维持中的作用

基本信息

批准号：
13214057
负责人：
和賀祥
金额：
$ 21.95万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物のDNA複製の分子機構の解明を通じて、ゲノム安定性維持のメカニズムを理解することを目標に研究を進めた。特に本研究では、ゲノム不安定化を特徴とする遺伝病Werner症候群のの原因遺伝子産物WRNヘリカーゼのDNA代謝における機能を明らかにすることを目的に、アフリカツメガエル卵DNA複製系を利用した生化学的な解析を進めた。これまでに、WRNとともに複製因子PolδやRPAのクロマチンへの結合が複製進行の一時停止に伴って特異的に増加することを見いだしている。このクロマチン結合の定量解析の結果、通常の複製時には低レベルのWRNのクロマチン結合しか見られないが、ポリメラーゼ阻害剤による複製停止に伴い、それまでに形成されていた複製フォークの数に相当する分子数のWRNがクロマチンに結合することが示された。そこで、特異的抗体でWRNを除去した卵抽出液を調製し、複製進行阻害を引き起こすMMSで前処理したクロマチン鋳型を使った複製あるいは低濃度のポリメラーゼ阻害剤存在下での複製を行ったが、WRN除去による顕著な影響は見られなかった。ところが、MMS無処理および阻害剤非存在下の複製においてWRN除去した場合にヒストンH2AXの顕著なリン酸化が検出された。さらに、その際のDNA合成量もWRN除去によってわずかに低下した。以上の結果から、WRNは正常の複製時においても重要な働きをしており、その破綻はゲノムの不安定化に導く可能性が考えられる。

我们的研究旨在通过阐明真核生物DNA复制的分子机制，了解基因组稳定性维持的机制。特别是，本研究旨在阐明 WRN 解旋酶（Werner 综合征（一种以基因组不稳定为特征的遗传性疾病）的致病基因产物）在 DNA 代谢中的功能。到目前为止，我们发现WRN、复制因子Polδ和RPA与染色质的结合随着复制进程的暂停而特异性增加。这种染色质结合定量分析的结果是，在正常复制过程中仅观察到低水平的 WRN 染色质结合，但当通过聚合酶抑制剂停止复制时，与先前形成的复制叉数量相对应的分子会出现几个 WRN。显示与染色质结合。因此，我们制备了使用特异性抗体去除 WRN 的鸡蛋提取物，并使用经过 MMS 预处理的染色质模板进行复制，MMS 会抑制复制进程，或者在低浓度聚合酶抑制剂存在的情况下，WRN 去除没有显着影响。被观察到。然而，如果在复制过程中去除 WRN（无需 MMS 处理或没有抑制剂），则检测到组蛋白 H2AX 显着磷酸化。此外，由于WRN的去除，当时合成的DNA量也略有减少。上述结果表明WRN即使在正常复制过程中也发挥着重要作用，其崩溃可能导致基因组不稳定。