真核生物複製フォークの染色体複製およびゲノム安定性維持における役割

真核复制叉在染色体复制和基因组稳定性维持中的作用

基本信息

批准号：
13214057
负责人：
和賀祥
金额：
$ 21.95万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物のDNA複製の分子機構の解明を通じて、ゲノム安定性維持のメカニズムを理解することを目標に研究を進めた。特に本研究では、ゲノム不安定化を特徴とする遺伝病Werner症候群のの原因遺伝子産物WRNヘリカーゼのDNA代謝における機能を明らかにすることを目的に、アフリカツメガエル卵DNA複製系を利用した生化学的な解析を進めた。これまでに、WRNとともに複製因子PolδやRPAのクロマチンへの結合が複製進行の一時停止に伴って特異的に増加することを見いだしている。このクロマチン結合の定量解析の結果、通常の複製時には低レベルのWRNのクロマチン結合しか見られないが、ポリメラーゼ阻害剤による複製停止に伴い、それまでに形成されていた複製フォークの数に相当する分子数のWRNがクロマチンに結合することが示された。そこで、特異的抗体でWRNを除去した卵抽出液を調製し、複製進行阻害を引き起こすMMSで前処理したクロマチン鋳型を使った複製あるいは低濃度のポリメラーゼ阻害剤存在下での複製を行ったが、WRN除去による顕著な影響は見られなかった。ところが、MMS無処理および阻害剤非存在下の複製においてWRN除去した場合にヒストンH2AXの顕著なリン酸化が検出された。さらに、その際のDNA合成量もWRN除去によってわずかに低下した。以上の結果から、WRNは正常の複製時においても重要な働きをしており、その破綻はゲノムの不安定化に導く可能性が考えられる。

这项研究的目的是通过阐明真核生物的DNA复制的分子机制来理解基因组稳定性的机制。特别是，这项研究使用爪蟾DNA复制系统进行了生化分析，目的是澄清WRN解旋酶的功能，WRN解旋酶是遗传疾病Werner综合征的基因产物，在DNA代谢中以基因组破坏稳定为特征。迄今为止，我们发现复制因子POLδ和RPA与染色质的结合以及WRN的结合随着复制进展的停滞而特别增加。染色质结合的定量分析表明，尽管由于聚合酶抑制剂终止复制，但在正常复制过程中仅发现WRN的染色质结合较低，但与现在形成的复制叉数量相对应的复制叉数量相对应的分子的复制终止，但现在形成了与染色质结合。因此，制备用特定抗体去除WRN的卵提取物，并使用用MMS预处理的染色质模板进行复制，该模板会导致复制进展，或者在低浓度的聚合酶抑制剂的情况下进行复制，但没有观察到WRN去除的显着影响。然而，当在没有MMS的复制中去除WRN时，在没有MMS的情况下并且在没有抑制剂的情况下检测到了组蛋白H2AX的显着磷酸化。此外，此时DNA合成量通过WRN去除略微降低。从以上结果来看，WRN在正常复制过程中也起着重要作用，并且分解可能导致基因组不稳定。