宿主と連携したEBウイルスDNA複製開始機構の解明と人工複製開始点構築への応用

阐明EB病毒DNA与宿主协同复制启动机制及其在人工复制起点构建中的应用

基本信息

批准号：
20055010
负责人：
和賀祥
金额：
$ 3.07万
依托单位：
Japan Women's University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20055010/
关键词：
EBウイルス EBNA1 DNA複製 ORC

项目摘要

EBウイルスDNAがもつ複製開始点oriPは、そこからの複製にヒト複製開始因子ORCが必要であることから、哺乳細胞DNA複製の良いモデル系となっている。oriP複製には、ウイルス由来複製因子EBNA1が必要であるが、EBNA1の役割の詳細は未だ明らかではない。これまでの解析から、精製したORC複合体がG-rich RNAに高い親和性を有することを見出している。この結果と既に報告のあるEBNA1のもつG-rich RNA結合活性とを考え合わせ、共通RNAを介したEBNA1-RNA-ORC複合体がoriPで形成する可能性が考えられた。そこで本年度は、この可能性をin vivo解析で証明するために、まずRNA結合活性を欠損したEBNA1変異体の作製を行った。EBNA1は直接RNA結合に関わると考えられるRGGモチーフを2つ有する。本解析ではこのRGGモチーフ内の重要なアミノ酸を別種に置換した変異体の作製を行った。そして、作製した変異体をヒト培養細胞で発現させたところ、いずれの変異体も野生型と同様に、発現したEBNA1は核に局在した。このことは、作製した変異EBNA1が今後のin vivo複製アッセイによるEBNA1機能解析に利用できることを示す。また、EBNA1の解析と平行して本年度は、細胞性転写因子かつ複製開始因子であるAlF-Cに着目した解析に着手した。この因子は、DNA配列特異的DNA結合タンパク質であるが、そのアミノ酸配列からRNA結合活性も有することが推測された。本年度はその組換え体AlF-Cを使った解析から、実際にRNA結合活性を有すること、さらにEBNA1と同様にG-richのRNAに結合選択性があることが分かった。今後、AlF-Cについても、共通のRNAを介したORCとの複合体形成が特定のDNA上で起こるのかを明らかにしていきたい。

EB病毒DNA的复制起点oriP需要人类复制起始因子ORC才能复制，使其成为哺乳动物细胞DNA复制的良好模型系统。 oriP复制需要病毒来源的复制因子EBNA1，但EBNA1的作用细节仍不清楚。从我们之前的分析中，我们发现纯化的ORC复合物对富含G的RNA具有高亲和力。考虑到这一结果以及之前报道的 EBNA1 富含 G 的 RNA 结合活性，认为 EBNA1-RNA-ORC 复合物可能通过共同的 RNA 在 oriP 处形成。因此，今年，为了通过体内分析证明这种可能性，我们首先创建了缺乏RNA结合活性的EBNA1突变体。 EBNA1 有两个 RGG 基序，被认为直接参与 RNA 结合。在这项分析中，我们创建了突变体，其中该 RGG 基序中的重要氨基酸被不同的物种取代。当创建的突变体在培养的人类细胞中表达时，表达的 EBNA1 位于两个突变体的细胞核中，与野生型相似。这表明产生的突变体 EBNA1 可用于未来使用体内复制测定的 EBNA1 功能分析。此外，在分析 EBNA1 的同时，今年我们开始了针对 AlF-C 的分析，AlF-C 是一种细胞转录因子和复制起始因子。虽然该因子是DNA序列特异性的DNA结合蛋白，但从其氨基酸序列推断它也具有RNA结合活性。今年，使用重组 AlF-C 进行的分析表明，它实际上具有 RNA 结合活性，并且像 EBNA1 一样，对富含 G 的 RNA 具有结合选择性。未来，我们希望阐明AlF-C是否通过特定DNA上的共同RNA与ORC形成复合物。