真核生物の染色体複製における複製フォークの機能とその制御

复制叉在真核染色体复制中的功能和调控

• 批准号: 17013054
• 负责人: 和賀 祥
• 金额: $ 17.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17013054/
• 关键词: DNA複製; EB ウイルス; oriP; ORC; EBNA1; 複製フォーク; 複製開始点; pre-RC形成; アフリカツメガエル卵抽出液; 複製開始因子; MCM; DNA複製; EB ウイルス; oriP; ORC; EBNA1; 複製フォーク; 複製開始点; pre-RC形成; アフリカツメガエル卵抽出液; 複製開始因子; MCM

本年度は、複製開始点での分子メカニズムを明らかにする目的で、潜伏感染Epstein-Barr(EB)ウイルスの複製開始点oriPに着目し、そこでのウイルス性複製因子EBNA1と宿主由来複製開始因子ORCとの相互作用について解析を行つた。各因子はバキュロウイルスベクターを用いた発現系により過剰発現させ、組換え体因子を調製した。これらを用いてoriP配列を含むDNAへの結合を解析したところ、EBNA1が存在するとORCのDNA結合が安定化することが明らかとなった。さらにグロマチン免疫沈降法により結合領域を調べたところ、EBNA1存在下でORCはoriP近傍に優先的に結合することが分かった。以上の結果から、oriP配列に結合したEBNA1は直接的な相互作用によってORCをoriPヘリクルートすることが示された。この結果は、これまで長い間不明であったEBNA1の複製開始における役割を初めて具体的に示すものとして重要である。さらに、EBNA1のドメイン解析も進め、DNAが無い条件下でもORCと相互作用できるEBNA1の領域を同定した。一方、EBNA1はRNA結合活性を有することが知られており、また今回同定したORC結合領域もRNA結合活性を有することが判明した。さらに、これまでの解析からRNAがORCとEBNA1との相互作用を強める効果がある可能性が示され、また、RNAがORCのDNA結合を阻害するのに対し、EBM1を加えることによってそのRNAによる阻害効果が減少することが示された。以上のことは、oriPにおける複製開始ステップにRNAが関与することを示唆し、RNAを介した新たな複製開始調節機構が明らかになる可能性を示している。

在今年，我们专注于orip，即受到潜在感染的爱泼斯坦 - 巴尔（EB）病毒的复制的起源，并分析了病毒复制因子EBNA1与宿主衍生的复制因子ORC之间的相互作用。使用杆状病毒载体制备重组因子的表达系统过表达每个因素。使用这些，我们分析了与含有Orip序列的DNA的结合，并发现EBNA1的存在稳定了ORC的DNA结合。此外，当通过Glomatin免疫沉淀检查结合区域时，发现ORC在EBNA1存在下优先与Orip附近结合。以上结果表明EBNA1通过直接相互作用结合到Orip序列直升机兽人。该结果很重要，因为它是EBNA1复制启动的作用的第一个具体表示，长期以来一直未知。此外，进行了EBNA1的结构域分析，即使在无DNA条件下，EBNA1的区域也可以与ORC相互作用。另一方面，已知EBNA1具有RNA结合活性，并且还发现这次确定的ORC结合区域也具有RNA结合活性。此外，先前的分析表明，RNA可能具有加强ORC和EBNA1之间的相互作用的作用，而RNA抑制了ORC中的DNA结合，但添加EBM1会降低RNA的抑制作用。以上表明RNA参与ORIP的复制启动步骤，表明将揭示新的RNA介导的复制起始调节机制的可能性。