真核生物の染色体複製における複製フォークの機能とその制御

复制叉在真核染色体复制中的功能和调控

基本信息

批准号：
17013054
负责人：
和賀祥
金额：
$ 17.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、複製開始点での分子メカニズムを明らかにする目的で、潜伏感染Epstein-Barr(EB)ウイルスの複製開始点oriPに着目し、そこでのウイルス性複製因子EBNA1と宿主由来複製開始因子ORCとの相互作用について解析を行つた。各因子はバキュロウイルスベクターを用いた発現系により過剰発現させ、組換え体因子を調製した。これらを用いてoriP配列を含むDNAへの結合を解析したところ、EBNA1が存在するとORCのDNA結合が安定化することが明らかとなった。さらにグロマチン免疫沈降法により結合領域を調べたところ、EBNA1存在下でORCはoriP近傍に優先的に結合することが分かった。以上の結果から、oriP配列に結合したEBNA1は直接的な相互作用によってORCをoriPヘリクルートすることが示された。この結果は、これまで長い間不明であったEBNA1の複製開始における役割を初めて具体的に示すものとして重要である。さらに、EBNA1のドメイン解析も進め、DNAが無い条件下でもORCと相互作用できるEBNA1の領域を同定した。一方、EBNA1はRNA結合活性を有することが知られており、また今回同定したORC結合領域もRNA結合活性を有することが判明した。さらに、これまでの解析からRNAがORCとEBNA1との相互作用を強める効果がある可能性が示され、また、RNAがORCのDNA結合を阻害するのに対し、EBM1を加えることによってそのRNAによる阻害効果が減少することが示された。以上のことは、oriPにおける複製開始ステップにRNAが関与することを示唆し、RNAを介した新たな複製開始調節機構が明らかになる可能性を示している。

今年，为了阐明复制起点的分子机制，我们重点研究了潜伏感染的EB病毒的复制起点oriP，以及病毒复制因子EBNA1和宿主源性复制起始因子ORC。我们分析了之间的相互作用。使用杆状病毒载体的表达系统过表达各因子，并制备重组因子。使用这些来分析与含有 oriP 序列的 DNA 的结合，我们发现 EBNA1 的存在稳定了 ORC 与 DNA 的结合。此外，我们通过球蛋白免疫沉淀研究了结合区域，发现在 EBNA1 存在的情况下，ORC 优先结合到 oriP 附近。这些结果表明，EBNA1 与 oriP 序列结合，通过直接相互作用将 ORC 募集到 oriP。这一结果很重要，因为它是首次具体证明 EBNA1 在复制启动中的作用，而这一作用长期以来一直未知。此外，我们对 EBNA1 进行了结构域分析，并鉴定了 EBNA1 的一个区域，即使在没有 DNA 的情况下也可以与 ORC 相互作用。另一方面，已知EBNA1具有RNA结合活性，此次鉴定的ORC结合区域也被发现具有RNA结合活性。此外，之前的分析表明RNA可能具有加强ORC和EBNA1之间相互作用的作用，而RNA虽然抑制ORC的DNA结合，但添加EBM1表明抑制作用减弱。以上提示RNA参与oriP的复制起始步骤，并提示可能揭示一种新的RNA介导的复制起始调控机制。