発達期の中枢神経系におけるシナプス除去機構:In-vitroアプローチによる研究

发育中的中枢神经系统中的突触去除机制：使用体外方法的研究

基本信息

批准号：
13035016
负责人：
田端俊英
金额：
$ 4.29万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

発達期における過剰シナプスの除去は脳神経回路の精緻化に不可欠である。小脳の登上線維(CF)-プルキンエ細胞(PC)シナプスはシナプス除去の代表的モデルであるが、その素過程であるPC樹状突起に対するCF間競合を連続観察する技術の開発を行った。基本戦略として、異なる蛍光色素で標識したマウス胎児由来の下オリーブ核(IO)片と単離PCを共培養し、それらの神経突起をレーザー共焦点顕微鏡で観察する方法を採った。IOを200μm角に手動スライスしたものから500μm内外のCF様突起が伸展した。酵素処理やピペッティングにより作成したIO片では突起が伸展しなかった。手動スライスIO片に蛍光色素を塗布したが、突起伸展が盛んなIO片深部のニューロンを標識できなかった。そこで脂溶性蛍光色素(DiIなど)を金属微粒子に載せてジーンガンによりIO片に打ち込んだ。Polyvinylpyrrolidoneを用いて1弾丸当たりの微粒子数を高密度化し、比較的高い圧力(100psi)で射出することにより、極めて効率良くCF様突起を標識できた。PCの蛍光標識は特異的プロモーターL7の制御により蛍光物質GFPを遺伝子発現するマウスの作出により実現した。以上の方法で準備したIO片とPCを小脳グリア由来神経栄養因子であるL-セリンを含む超低血清培地と顕微鏡上に設けた小型炭酸ガス・インキュベーターを用いて維持することにより、数日〜2週間に渡ってCF様突起伸展を観察できた。インキュベーター内温度変化により標本が上下動する問題が生じたが、インキュベーターを恒温テントで覆うことにより解決し、共焦点顕微鏡による高倍率長時間連続観察が可能になった。更にシナプス形成の効率改善を目的として神経突起伸展促進因子を探索した結果、1型インスリン様成長因子がp38キナーゼなどを介してPC樹状突起発達を促進することを明らかにした。

消除发育过程中多余的突触对于完善颅神经回路至关重要。小脑攀岩纤维（CF）-Purkinje Cell（PC）突触是突触去除的代表性模型，我们已经开发了一种技术来连续观察CF竞争PC Dendrites，这是一个基本过程。作为一种基本策略，将分离的PC与带有不同荧光染料标记的小鼠胎儿的亚亮核（IO）碎片共培养，并在激光共聚焦显微镜下观察到神经突。从IO手动将500μm内外的CF样突起延伸至200μm正方形。这些突出没有扩展在酶处理或移液中产生的IO碎片中。将手动切成薄片的IO片涂有荧光染料，但是在IO碎片深处的神经元（易于突起）无法标记。然后将脂溶性荧光染料（例如DII）放在细金属颗粒上，然后使用基因枪将其驱动到IO片段中。通过使用聚乙烯基吡咯烷酮来增加每个子弹的细颗粒数量并在相对较高的压力（100 psi）中注入它，CF样突起非常有效。 PC的荧光标记是通过通过控制特定启动子L7的控制表达荧光物质GFP的小鼠来实现的。通过使用上述方法维持IO碎片和PC，使用含有L丝氨酸的超低血清培养基，小脑神经胶质衍生的神经营养因子以及安装在显微镜上的小二氧化碳孵化器的小型二氧化碳孵化器，可以观察到CF样的突起，几天至两周。孵化器的温度变化引起了在上下移动的样品的问题，但是通过用恒定的温度帐篷覆盖孵化器来解决，从而可以长时间使用共聚焦显微镜进行高磁化的连续观察。此外，我们搜索了神经突生长启动子以提高突触的形成效率，发现1型胰岛素样生长因子通过p38激酶等促进PC树突状发育。