発達期の中枢神経系におけるシナプス除去機構:In-vitroアプローチによる研究

发育中的中枢神经系统中的突触去除机制：使用体外方法的研究

基本信息

批准号：
13035016
负责人：
田端俊英
金额：
$ 4.29万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

発達期における過剰シナプスの除去は脳神経回路の精緻化に不可欠である。小脳の登上線維(CF)-プルキンエ細胞(PC)シナプスはシナプス除去の代表的モデルであるが、その素過程であるPC樹状突起に対するCF間競合を連続観察する技術の開発を行った。基本戦略として、異なる蛍光色素で標識したマウス胎児由来の下オリーブ核(IO)片と単離PCを共培養し、それらの神経突起をレーザー共焦点顕微鏡で観察する方法を採った。IOを200μm角に手動スライスしたものから500μm内外のCF様突起が伸展した。酵素処理やピペッティングにより作成したIO片では突起が伸展しなかった。手動スライスIO片に蛍光色素を塗布したが、突起伸展が盛んなIO片深部のニューロンを標識できなかった。そこで脂溶性蛍光色素(DiIなど)を金属微粒子に載せてジーンガンによりIO片に打ち込んだ。Polyvinylpyrrolidoneを用いて1弾丸当たりの微粒子数を高密度化し、比較的高い圧力(100psi)で射出することにより、極めて効率良くCF様突起を標識できた。PCの蛍光標識は特異的プロモーターL7の制御により蛍光物質GFPを遺伝子発現するマウスの作出により実現した。以上の方法で準備したIO片とPCを小脳グリア由来神経栄養因子であるL-セリンを含む超低血清培地と顕微鏡上に設けた小型炭酸ガス・インキュベーターを用いて維持することにより、数日〜2週間に渡ってCF様突起伸展を観察できた。インキュベーター内温度変化により標本が上下動する問題が生じたが、インキュベーターを恒温テントで覆うことにより解決し、共焦点顕微鏡による高倍率長時間連続観察が可能になった。更にシナプス形成の効率改善を目的として神経突起伸展促進因子を探索した結果、1型インスリン様成長因子がp38キナーゼなどを介してPC樹状突起発達を促進することを明らかにした。

在开发期间，除去多余的突触对于脑电路的优雅是必不可少的。脑攀岩纤维（CF）-Purkin-E细胞（PC）突触是用于去除突触的代表性模型，但已经开发了技术来连续观察到针对PC树突状预测的CF竞争。作为一种基本策略，我们采用了一种co培养的方法下橄榄核（IO）和源自具有不同荧光色素的小鼠胎儿色素的孤立PC，并观察了具有激光聚焦显微镜的神经爆发。 500μm内部和外部的CF样突出从一个正方形的IO延伸到IO。突起并没有通过酶处理和移液产生的IO碎片扩展。将荧光染料应用于手动切片io件，但不可能在一个深度的IO中签署神经元，该神经元具有繁荣的突出和拉伸。因此，将脂肪 - 溶性荧光色素（例如DII）放在金属颗粒上，并用牛仔枪驱动进入IO碎片。使用聚乙烯基吡啶酮的细胞数量高度密度密度密集，并且通过以相对较高的高压（100PSI）进行射击，CF样投影非常有效。小鼠通过控制特定的启动子L7来表达荧光物质GFP的小鼠实现了PC的荧光标志。几天，在上述方法中制备的IO碎片和PC可以通过在显微镜上提供的超低碳二氧化碳和小二氧化碳孵化器来维持，其中包括L塞林，这是一个小脑的神经营养因子。 CF类似预测和延伸两个星期。由于孵化器的温度变化，样品已上下移动，但是通过用恒定的温度帐篷覆盖孵化器来解决，这使得由于CO -Cocus -Opocus造成的高磁化能力很长时间。显微镜。此外，由于探索神经投射扩展促进因子以提高突触形成的效率，因此揭示了1型胰岛素样生长因子将通过p38激酶等促进PC矮人突出发育。