ジーン・ガンによる中枢ニューロンヘのシグナリング試薬・細胞内ローディング

Gene Gan 的信号试剂和细胞内负载至中枢神经元

基本信息

批准号：
15650075
负责人：
田端俊英
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ニューロンの細胞内シグナリングを分析するために有用な試薬のほとんどが親水性すなわち低細胞膜透過性であり、生きた細胞標本に投与することが困難である。本研究では遺伝子導入に利用されているジーン・ガン(空気銃)を応用して、親水性試薬を付着させた弾丸(金属微粒子)を細胞内投与する技術の開発に取り組んだ。本年度は昨年度に開発した基礎技術の洗練と実用化を目指した。(1)中枢ニューロンへの最適化:培養マウス小脳ニューロンをモデルとして投与プロトコールを改良した。射出ガス圧を上げると細胞内導入効率が増すが、衝撃波や爆風により細胞が傷害された。この問題は昨年度に開発した爆風回避装置と低ガス圧(80〜90psi)で何回かに分けて投与を行うプロトコールを用いることで大幅に改善できた。弾丸が通過する培地層を厚くすることで細胞が保護できるかも検討したが、培地層が数ミリメーターを越えると導入効率が急激に低下してしまうことが分かった。(2)投与濃度のコントロール:一定の濃度の試薬を細胞内投与するためには、i.弾丸に付着した試薬の濃度、ii.薬莢に含まれる弾丸の数などが重要なファクターであることが分かった。iについては直径の小さな(0.6ミクロン)研磨済み金粒子の方が、直径が大きく(1ミクロン)表面に凹凸があるタングステン粒子より試薬の付着濃度が一定することが分かった。iiは薬莢の製造ムラに起因するもので、a)薬莢を使用前に蛍光顕微鏡で直接検査して弾丸数の揃ったロットに選り分けるとともに、b)それぞれのロットのサンプルでパラフィルムに向かって試射を行い、パラフィルムに命中した弾丸の密度から細胞内導入効率を予測することで概ね解決できた。蛍光カルシウムインジケーターをモデル試薬とした比較では、ジーン・ガンによる細胞内導入後5〜10分での細胞内蛍光輝度が、従来のパッチクランプ記録電極から細胞内に拡散させる方法で数十分投与した場合よりも強く、ジーン・ガンによってカルシウム濃度の測定や制御に十分な濃度の試薬を細胞内投与できることが分かった。

大多数可用于分析神经元细胞内信号传导的试剂都是亲水性的，即具有低细胞膜渗透性，使得它们难以施用到活细胞制剂中。在这项研究中，我们应用用于基因转移的基因枪（气枪）开发了一种将附着有亲水性试剂的子弹（金属颗粒）注射到细胞内的技术。今年，我们的目标是把去年开发的基础技术完善并实用化。 (1)中枢神经元优化：以培养的小鼠小脑神经元为模型，改进给药方案。增加注射气体压力可提高引入细胞的效率，但细胞会因冲击波和冲击波而受损。通过使用去年开发的防爆装置和在低气压（80-90 psi）下分多次给药的方案可以大大改善这个问题。他们考虑是否可以通过增加子弹穿过的介质层的厚度来保护细胞，但他们发现当介质层超过几毫米时，引入效率急剧下降。 (2)施用浓度的控制：为了将试剂以恒定的浓度施用到细胞中，重要的因素包括i.附着在子弹上的试剂的浓度，以及ii.子弹中包含的子弹的数量。。关于i，发现试剂的附着浓度在小直径（0.6微米）的抛光金颗粒上比在大直径（1微米）和不平坦表面的钨颗粒上更恒定。 ii是由于弹药筒的制造不均匀；a）在使用前直接用荧光显微镜检查弹药筒，将其分成具有相同数量子弹的批次，并且b）使用石蜡膜对每批样品进行粗略处理。通过进行测试射击并根据击中封口膜的子弹密度预测进入细胞的效率来解决问题。在使用荧光钙指示剂作为模型试剂的比较中，使用常规膜片钳记录电极通过施用几分钟后的细胞内荧光强度测定使用Gene Gunn引入细胞后5至10分钟的细胞内荧光亮度，研究发现，基因癌允许在细胞内施用足以测量和控制钙浓度的试剂。