脳のカルシウム/カルモデュリン/キナーゼ/キナーゼ・カスケード

脑钙/钙调蛋白/激酶/激酶级联

• 批准号: 07278202
• 负责人: 藤澤 仁
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07278202/
• 关键词: カルシウム; カルモデュリン; 脳; タンパク質リン酸化酵素; シグナル伝達; 酵素活性の調節機構; タンパク質リン酸化反応; プロテインキナーゼキナーゼ

カルシウム/カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IV.(CaMキナーゼIV)をリン酸化して著明に活性化するCaMキナーゼIVキナーゼを精製し、精製した酵素をトリプシン消化して得たペプチドをHPLCで精製しその部分アミノ酸配列を決め、対応するオリゴヌクレオチドからPCRでプローブを作成し、そのプローブを用いてラットの脳のcDNAライブラリーからCaMキナーゼIVキナーゼのクローニングを行い、そのヌクレオチド配列を決めた。ヌクレオチド配列から推定された酵素のC末端部分のアミノ酸配列をもつペプチドを合成してウサギを免疫しCaMキナーゼIVキナーゼに対する特異抗体を調製した。こうして得たクローン化したCaMキナーゼIVキナーゼに対する特異抗体を用いて免疫組織化学的に酵素の脳内部位分布、細胞内分布を調べ、CaMキナーゼIVの分布と比較検討したところ、クローン化したCaMキナーゼIVキナーゼはCaMキナーゼIVと同様に脳内に広く分布しているが、CaMキナーゼIVが豊富に存在する小脳の顆粒細胞層には殆ど存在しないことが明らかになった。CaMキナーゼIVキナーゼの細胞内分布はCaMキナーゼIVと同様に細胞の核に限局して存在しており、CaMキナーゼIVキナーゼし神経細胞の核の中でCaMキナーゼIVをリン酸化して活性化する可能性が考えられた。CaMキナーゼIVキナーゼはin vitroの実験ではCaMキナーゼIVのみならずCaMキナーゼIをも著明に活性化するが、CaMキナーゼIが細胞の核には存在せず細胞質に分布するというこれまでの報告を考え併せると、我々が脳からクローン化したCaMキナーゼIVキナーゼはCaMキナーゼIVを活性化するための酵素である可能性が高いと思われる。またimmunotitrationの実験は小脳のCaMキナーゼIVキナーゼ活性の4分の1程度しか抗体と反応しないことを示しており、CaMキナーゼIVキナーゼが小脳の顆粒細胞層に殆ど存在しないという実験結果を併せて考えると、小脳には我々や米国のSoderlingらによってクローン化されたCaMキナーゼIVキナーゼとは異なるアイソフォームが存在する可能性が考えられる。

我们纯化了 CaM 激酶 IV 激酶，该激酶磷酸化并显着激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaM 激酶 IV)，并使用 HPLC 纯化了通过胰蛋白酶消化纯化酶获得的肽。 Perilla等人通过PCR从相应的寡核苷酸中创建了探针，使用该探针从大鼠脑cDNA文库中克隆了CaM激酶IV激酶，并测定了其核苷酸序列。合成具有从核苷酸序列推导的酶的C末端部分的氨基酸序列的肽，并免疫兔子以制备针对CaM激酶IV激酶的特异性抗体。使用由此获得的针对克隆的CaM激酶IV激酶的特异性抗体，我们通过免疫组织化学方法研究了该酶的脑部位分布和细胞内分布，并将其与CaM激酶IV的分布进行比较，我们发现克隆的CaM激酶虽然IV激酶，与CaM激酶IV一样，广泛分布于大脑中，但已发现它在CaM激酶IV丰富的小脑颗粒细胞层中几乎不存在。与CaM激酶IV类似，CaM激酶IV激酶的细胞内分布定位于细胞核，并且CaM激酶IV激酶在神经细胞的细胞核中磷酸化并激活CaM激酶IV，我认为这是可能的。在体外实验中，CaM激酶IV激酶不仅显着激活CaM激酶IV，而且还显着激活CaM激酶I，但之前的报道表明CaM激酶I不存在于细胞核中，而是分布在细胞质中，综合来看，这似乎是可能的。我们从大脑中克隆的 CaM 激酶 IV 激酶是一种激活 CaM 激酶 IV 的酶。此外，免疫滴定实验表明，小脑中只有约四分之一的CaM激酶IV激酶活性与抗体发生反应，这与实验结果表明，CaM激酶IV激酶在小脑的颗粒细胞层中几乎不存在。因此，小脑中可能存在与我们和Soderling等人在美国克隆的CaM激酶IV激酶不同的亚型。

项目成果

A.Ishida: "Evidence that autophosphorylation at Thr-286/Thr-287 is required for full activation of calmodulin-dependent protein kinase II" Biochim.Biophys.Acta. (in press).

A.Ishida：“有证据表明 Thr-286/Thr-287 处的自磷酸化是钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II 完全激活所必需的”Biochim.Biophys.Acta。

T.Kitani: "Inactivation of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase IV by Ca^<2+>/Calmodulin and Restoration of the Activity by Mg^<2->/EGTA" J.Biochem.117. 1070-1075 (1995)

T.Kitani：“Ca ^ 2 /钙调蛋白对Ca ^ 2 /钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV的灭活以及Mg ^ 2-> /EGTA的活性恢复”J.Biochem.117。

S.Watanabe: "Inactivation of Calmodulin-dependent protein kinase IV by autophosphorylation of serine 332 within the putative calmodulin-binding domain" J.Biol.Chem.(in press).

S.Watanabe：“通过推定钙调蛋白结合域内丝氨酸 332 的自磷酸化使钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV 失活”J.Biol.Chem.（出版中）。

A.Ishida: "Stabilization of Calmodulin-dependent Protein Kinase II through the Autoinhibitory Domain" J.Biol.Chem.270. 2163-2170 (1995)

A.Ishida：“通过自抑制结构域稳定钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II”J.Biol.Chem.270。

S.Takasawa: "Requirement of calmodulin-dependent protein kinase II in cyclic ADP-ribose-mediated intracellular Ca^<2-> mobilization" J.Biol.Chem.270. 30257-30259 (1995)

S.Takasawa：“环ADP-核糖介导的细胞内Ca 2- 动员中钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的需求”J.Biol.Chem.270。