生合成反応の遺伝子レベルでの精密な解析と超天然酵素分子の創製

在基因水平上精确分析生物合成反应并创造超天然酶分子

基本信息

批准号：
06240207
负责人：
斉藤和季
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06240207/
关键词：
二次代謝物薬用資源生合成アミノ酸

项目摘要

[目的]薬用植物成分の生合成に関わる遺伝子をクローン化し、異種生物で高発現することによりその生産を図る研究は、今後ますます重要な課題になると思われる。植物に含まれる非タンパク性β-置換アラニン類には、スイカなどのウリ科植物に特異的なβ-ピラゾールアラニンをはじめ、ギンゴウカン(Leucaena leucocephala)に含まれるミモシンや、シクンシ(Quisqualis indica var.villosa)に含まれる中枢神経興奮性グルタミン酸レセプターのアゴニストとして注目を集めているキスカル酸など薬学的に興味深い物質が多い。これらの非タンパク性β-置換アラニン類の生合成は、ピリドキサールリン酸のアミノアクリル酸中間体を共通の酵素反応中間体として、システイン合成酵素によって触媒されている。そこでスイカシステイン合成酵素cDNAの大腸菌高発現系を作製し、この系を用いてこれら非タンパク性β-置換アラニン類のin vitroおよびin vivo合成に応用した。[方法・結果]スイカ発芽体からクローン化したシステイン合成酵素cDNA[1]をT7プロモーターを持つ大量発現ベクターpET3dのNcoI部位に導入したプラスミドpCEN1を構築した。このプラスミドをT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が溶原化した大腸菌BL21に導入したところ、スイカシステイン合成酵素タンパクが大腸菌全タンパクの10〜20%に達した。大腸菌の無細胞抽出液中に基質を加え反応させたin vitro酵素反応の結果、β-ピラゾールアラニンのみならず、キスカル酸、ミモシンの生合成も可能であった。また、この高発現系の大腸菌培養液中にβ-ピラゾールアラニン生合成の前駆体であるピラゾールと0-アセチルセリンあるいはセリンおよび誘導剤IPTGを加えて培養したところ、培養液中にβ-ピラゾールアラニンが蓄積した。以上のように異種生物でのこれら植物特異的二次代謝産物の大量生産系を確立することができた。

[目的]研究参与药用植物成分的生物合成的基因克隆及其在异源生物中高表达的生产的基因的研究可能会在未来成为一个越来越重要的问题。 Non-proteinous β-substituted alanines contained in plants include many of the pharmaceutically interesting substances, such as β-pyrazolealanine, which is specific to Cucurbitaceae plants such as watermelon, mimosin found in Leucaena leucocephala, and kiscalic acid, which has attracted attention as an agonist of central nervous system excitatory glutamate receptors found in Quisqualis indica var.villosa。这些非蛋白质β取代的丙氨酸的生物合成使用吡ido醇磷酸盐的氨基酸中间体作为常见酶反应中间体催化了半胱氨酸合酶。因此，制备了高度表达的西瓜半胱氨酸合酶cDNA的大肠杆菌系统，并使用该系统将其应用于这些非蛋白质β-取代的丙氨酸的体外和体内合成。 [方法和结果]构建了质粒PCEN1，其中将从西瓜发芽剂克隆的半胱氨酸合酶cDNA [1]引入了含有T7启动子的质量表达载体的NCOI位点。当将这种质粒引入大肠杆菌BL21中，其中T7 RNA聚合酶基因被裂解时，西瓜半胱氨酸合酶蛋白达到了所有大肠杆菌蛋白的10-20％。由于体外酶促反应，将底物添加到大肠杆菌的无细胞提取物中，不仅是β-吡唑啉氨酸，而且还可以添加基质酸的生物合成和含羞草素的生物合成。此外，当吡喃唑（β-吡唑啉酸生物合成的前体）和0-乙酰基丝氨酸或丝氨酸或丝氨酸和诱导剂IPTG被添加到这种高度表达的大肠杆菌培养基中，并培养了β-吡唑啉酸酯在培养基中的β-吡唑啉氨酸积累。如上所述，有可能在异源生物中为这些特异性二级代谢产物建立质量生产系统。