ESTクローンを用いたアラビドプシスの天然物生合成系のリバースジェネティクス

使用EST克隆的拟南芥天然产物生物合成系统的反向遗传学

基本信息

批准号：
08878082
负责人：
斉藤和季
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】アントシアニン生合成において、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成反応はアントシアニジン合成酵素(ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ)(LDOX)により触媒されることが分子遺伝学的に示唆されている。しかし、本酵素の活性をin vitroで検出した例はなく、酸化酵素の他に脱水酵素の存在の可能性等、反応の詳細は明らかとされていない。そこで本研究ではアカジソ葉で特異的に発現するLDOXのcDNAを大腸菌で高発現させて得た組み換え精製タンパク質について、in vitroでの酵素化学的解析を行った。【実験・結果】1.LDOXの発現とアントシアニン含有量の解析LDOOXのNorthern解析並びにWestern解析を行ったところ、LDOXのmRNAとタンパク質はアカジソの葉と茎に特異的に発現していることが示され、これらの発現パターンは各組織のアントシアニン含有パターンに一致した。2.精製タンパク質の酵素化学的解析LDOX cDNAのORF領域を大腸菌高発現ベクターに導入し高発現系を構築した。その結果、発現誘導後の大腸菌抽出液にLDOX活性が確認された。この反応系より二価鉄イオン、アスコルビン酸、または2-オキソグルタル酸を除いた系ではLDOX活性の顕著な減少がみられ、LDOXが2-オキソグルタル酸依存性酸化酵素であることが生化学的に証明された。本組み換えタンパク質を精製し解析を行った結果、精製タンパク質においてもLDOX活性が確認された。このことから、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成には本酵素だけで必要十分であり、特異的な脱水酵素はなくても反応の進行することが明らかとなった。

[目的] 在花青素生物合成中，分子遗传学表明，无色花青素生成花青素的反应是由花青素合成酶（无色花青素双加氧酶）（LDOX）催化的。然而，还没有在体外检测到该酶的活性的案例，并且反应的细节，例如除了氧化酶之外还存在脱水酶的可能性，还没有明确。因此，在本研究中，我们对在大肠杆菌中高表达Academia叶特异表达的LDOX cDNA而获得的重组纯化蛋白进行了体外酶化学分析。 [实验/结果] 1.LDOX表达和花青素含量分析LDOOX的Northern和Western分析表明，LDOX mRNA和蛋白在桃金娘的叶和茎中特异表达，这些表达模式与各组织的花青素含量模式相匹配。 2.纯化蛋白的酶化学分析将LDOX cDNA的ORF区导入大肠杆菌高表达载体，构建高表达系统。结果，在表达诱导后的大肠杆菌提取物中确认了LDOX活性。当二价铁离子、抗坏血酸或2-酮戊二酸从该反应体系中去除时，观察到LDOX活性显着降低，这表明LDOX是一种2-酮戊二酸依赖性氧化酶。纯化并分析该重组蛋白的结果，在纯化的蛋白中也确认了LDOX活性。由此可知，仅该酶对于由无色花色素生成花色素来说是必要且充分的，并且即使在不存在特定的脱水酶的情况下反应也会进行。