植物の大規模ゲノムプロジェクト支援による天然物生合成系の逆遺伝学

大规模植物基因组项目支持的天然产物生物合成系统的反向遗传学

基本信息

批准号：
10878091
负责人：
斉藤和季
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

シロイヌナズナでは、現在までに3種類のセリンアセチル転移酵素SATaseアイソザイムの存在が知られているが、最近4種類目のSATaseをコードするゲノムおよびcDNA配列がデータベース上に報告された。そこでこのSAT106の機能解析を目的として、シロイヌナズナλYES cDNA libraryを用いてPCR法によりcDNAクローンの単離を行った。SAT106は全長約1kbであり、そのC末領域の1次構造はフィードバック阻害感受型、非感受型とは全く異なるタイプを示した。大腸菌発現系を用いた解析の結果、SAT106は大腸菌JM39/5のシステイン要求性を機能的に相補した。分子生物学におけるモデル植物であるシロイヌナズナでは、T-DNA挿入にもとづく変異体のタグラインシステムの整備が進んでおり、目的遺伝子の破壊変異体の分離に利用されている。本研究ではSATase遺伝子破壊変異体の分離を目的として、SAT-c、SAT-p、SAT-mについてスクリーニングを行った。その結果、SAT-cとSAT-mで一つずつラインが見い出された。また、いくつかの生理学的な結果から以前ミトコンドリア性のシステイン合成酵素として同定された蛋白質が、実はβ-シアノアラニン合成酵素ではないかと考えられた。そこでこのcDNAを大腸菌内で発現し、酵素活性測定、β-シアノアラニン合成酵素抗体を用いたイムノブロット分析によって確かに本蛋白質は、システイン合成酵素活性を有するものの実際にはβ-シアノアラニン合成酵素として機能していることを明らかにした。

在拟南芥中，已知存在三种类型的丝氨酸乙酰转移酶 SATase 同工酶，但最近编码第四种类型 SATase 的基因组和 cDNA 序列已在数据库中报道。因此，为了对SAT106进行功能分析，使用拟南芥λYES cDNA文库通过PCR分离cDNA克隆。 SAT106全长约1kb，其C端区域一级结构与反馈抑制敏感型和非反馈抑制敏感型完全不同。使用大肠杆菌表达系统进行分析的结果是，SAT106 在功能上补充了大肠杆菌 JM39/5 的半胱氨酸需求。在分子生物学模型植物拟南芥中，基于 T-DNA 插入的突变体标语系统已经开发出来，并用于分离目标基因破坏的突变体。在本研究中，我们筛选了 SAT-c、SAT-p 和 SAT-m，目的是分离 SATase 基因破坏突变体。结果，找到了 SAT-c 和 SAT-m 的一条线。此外，多项生理学结果表明，之前被鉴定为线粒体半胱氨酸合酶的蛋白质实际上可能是β-氰基丙氨酸合酶。因此，该cDNA在大肠杆菌中表达，并且使用β-氰基丙氨酸合酶抗体进行酶活性测量和免疫印迹分析表明，虽然该蛋白质确实具有半胱氨酸合酶活性，但它实际上并不充当β-氰基丙氨酸合酶。据透露，它的功能是