染色体凝縮因子の活性化の機序に関する生化学的研究

染色体浓缩因子激活机制的生化研究

• 批准号: 03256202
• 负责人: 山下 茂
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03256202/
• 关键词: 染色体凝縮; cdc2キナ-ゼ; MPF; M期開始; 細胞周期

生理的染色体凝縮因子であるMPFの活性化は、直接にはその1成分であるcdc2タンパク質の脱リン酸化によって生ずるが、何らかのタンパク質リン酸化がこれに関与すると推測される。このリン酸化をひきおこすプロテインキナ-ゼ及びその基質について無細胞系を用いて研究を行った。アフリカツメガエル未受精卵より調製したMPF硫安画分をATPγS存在下にインキュベ-トすると、MPF活性化がおこり、MPF及びcdc2キナ-ゼの活性はそれぞれ4倍、2倍に増加した。このインキュベ-ションの前後でcdc2タンパク質のSDSゲル電気泳動における易動度をイムノブロット法により比較すると、インキュベ-ションによる易動度の増加が観察された。これは、cdc2タンパク質が脱リン酸化されたことを示す。以上の変化はすべてATPγSに存在するので、何らかのタンパク質のチオリン酸化がcdc2タンパク質の脱リン酸化をひきおこし、MPFを活性化したと推測される。チオリン酸化を受ける基質を同定するため、MPF硫安画分を^<35>S‐ATPγSとともにインキュベ-トして ^<35>Sで標識されるタンパク質をSDSゲル電気泳動により調べると、110kDaのタンパク質が強く標識された。プロテインキナ-ゼ阻害薬であるK252aは、60μMでMPF及びcdc2キナ-ゼの活性化、cdc2タンパク質の脱リン酸化、110kDaタンパク質のチオリン酸化をいずれも強く抑制したが、20μMでは無効であった。以上から、110kDaタンパク質のチオリン酸化がMPFの活性化をひきおこす可能性が強く示唆される。

生理染色体凝结因子MPF的激活直接是由Cdc2蛋白的一种成分去磷酸化引起的，但假定某些蛋白质磷酸化涉及其中。使用无细胞系统研究了引起这种磷酸化的蛋白激酶及其底物。当在ATPγS存在下孵育从未施用的异荷蛋白卵中制备的MPF硫酸铵馏分时，MPF激活发生，MPF和CDC2 Quinase的活性分别增加了四次和两次。当比较通过免疫印迹前后SDS凝胶电泳中Cdc2蛋白的迁移率时，由于预孵育而观察到迁移率的增加。这表明CDC2蛋白已被脱磷酸化。以上所有变化都存在于ATPγs中，因此假定某些蛋白的硫磷酸化引起Cdc2蛋白的去磷酸化并激活的MPF。为了鉴定接受硫磷酸化的底物，将硫酸铵馏分与 ^<35> S-ATPγs孵育，并通过SDS凝胶电泳进行了标记为 ^<35> S的蛋白质，并将110 kDa蛋白强烈标记。 K252a是一种蛋白激酶抑制剂，强烈抑制MPF和CDC2激酶的激活，Cdc2蛋白的去磷酸化以及在60μM下的110 kDa蛋白的硫磷酸化，但在20μm下无效。上述强烈表明110 kDa蛋白的硫磷酸化可能导致MPF的激活。