インフルエンザウイルスNS1蛋白質による翻訳制御の分子機構

流感病毒NS1蛋白翻译控制的分子机制

基本信息

  • 批准号:
    09278211
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.54万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    1997
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1997 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1)インフルエンザウイルスの遺伝子発現調節は、翻訳段階でウイルスNS1蛋白が後期蛋白をコードするmRNAの翻訳開始部位上流に存在する翻訳調節シグナル(TRS)を認識して促進することにより行われる。2)ウイルス感染細胞を蛋白質リン酸化酵素阻害剤H8で処理するとNS1のリン酸化が阻害され、さらに後期蛋白の翻訳促進が特異的に阻害された。3)ヘルパーウイルスを必要としない新しいインフルエンザウイルスの遺伝子操作技術(RNase H法)を開発し、これを用いてNS1蛋白に変異を持つウイルスdl12とN110を作成した。dl12は、N端付近の12残基を欠失するが、温度感受性となり39℃で感染後期にすべてのウイルス蛋白の翻訳が特異的に阻害された。N110はC端側52%を欠失するが、すべての温度で後期蛋白の翻訳だけが特異的に阻害され、ウイルス産生は親株の5-10%に抑制された。4)これら親株と変異株のNS1を、培養細胞内でプラスミドベクターから発現する系を作成し解析を行った。また、GSTタッグを付けたこれらの蛋白を大腸菌で大量に発現し、アフィニティーカラムで精製し解析を行った。5)NS1のC端側52%に主たるリン酸化部位が存在する事が明らかとなった。6)NS1のリン酸化には、細胞内でG-キナーゼの関与が示唆されたが、in vitroのリン酸化反応では、精製A-キナーゼ、C-キナーゼ、G-キナーゼのいずれによっても同程度に強くリン酸化された。in vitroでは、リン酸化によるNS1の翻訳調節とRNP結合活性の調節は確認されなかった。7)WSNのNS1には結合するが変異N110のNS1には結合しない宿主蛋白を確認したので、さらに機能との関りから解析を進めている。
1) 流感病毒基因表达在翻译阶段受到病毒 NS1 蛋白的调节,该蛋白识别并促进位于编码晚期蛋白的 mRNA 翻译起始位点上游的翻译调节信号 (TRS)。 2)用蛋白激酶抑制剂H8处理病毒感染的细胞抑制NS1磷酸化并特异性抑制晚期蛋白的翻译促进。 3)我们开发了一种不需要辅助病毒的新型流感病毒基因工程技术(RNase H法),并利用该技术创建了NS1蛋白突变的病毒dl12和N110。尽管dl12删除了其N末端附近的12个残基,但它变得对温度敏感,并且在感染后期,所有病毒蛋白的翻译在39°C下被特异性抑制。尽管 N110 删除了 52% 的 C 末端,但晚期蛋白的翻译在所有温度下都受到特异性抑制,病毒产量被抑制为亲本毒株的 5-10%。 4)我们创建并分析了一个系统,其中亲本菌株和突变菌株NS1在培养细胞中从质粒载体表达。此外,这些 GST 标签蛋白在大肠杆菌中大量表达,使用亲和柱纯化并进行分析。 5) 结果表明,主要磷酸化位点存在于 NS1 C 端侧的 52% 处。 6)有人认为G-激酶参与细胞内NS1的磷酸化,但纯化的A-激酶、C-激酶和强磷酸化的G-激酶在体外也能进行相同程度的磷酸化反应。在体外,磷酸化诱导的 NS1 翻译和 RNP 结合活性调节尚未得到证实。 7) 我们已经鉴定出一种宿主蛋白​​,它与WSN的NS1结合,但不与突变体N110的NS1结合,我们正在对其功能进行进一步分析。

项目成果

期刊论文数量(6)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
榎並正芳: "第2版 微生物学実習提要(東京大学医科学研究所学友会編) 14、2、8 インフルエンザウイルスベクター" 丸善(株)(印刷中), (1998)
江波正义:“第2版微生物学实践概要(东京大学医学科学研究所校友会编)14、2、8流感病毒载体”丸善株式会社(正在出版),(1998年)
  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
榎並正芳: "インフルエンザウイルスNS1,NS2蛋白の構造,機能と発現制御" 日本臨床. 55. 2605-2609 (1997)
Masayoshi Enami:“流感病毒 NS1 和 NS2 蛋白的结构、功能和表达调节”日本临床杂志 55. 2605-2609 (1997)。
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  • 发表时间:
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
榎並正芳: "インフルエンザウイルスの分子生物学、-ウイルス工学と細胞生物学の接点" 実験医学. 15. 2356-2361 (1997)
Masayoshi Enami:“流感病毒的分子生物学 - 病毒工程与细胞生物学的交叉点”实验医学。 15. 2356-2361 (1997)
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