ミスマッチ認識および修復過程の生化学的研究

错配识别和修复过程的生化研究

• 批准号: 09269220
• 负责人: 秋山 昌広
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09269220/
• 关键词: ミスマッチ修復; 枯草菌; 自然突然変異

枯草菌ゲノムプロジェクトによりmutS遺伝子が見いだされたので、PCR法によりDNA断片を増幅しmutS遺伝子をクローン化した。クローン化したmutS遺伝子は全塩基配列を決定し、PCRエラーを含まないことを確認した。枯草菌mutS遺伝子をT7プロモーターの制御下におき、大腸菌内で分子量97,500ダルトンの枯草菌MutS蛋白質を大量に発現させた。その遺伝子産物をリゾチーム処理、硫安沈殿、Heparin Sepharoseカラム、MonoQカラムによってほぼ単一標品に精製した。枯草菌MutS蛋白質を精製するためのアッセイ系としては、^<32>Pでラベルしたミスペアを含む二本鎖DNA基質(Heteroduplex)によるゲルモビリティシフト法を用いた。枯草菌MutS蛋白質によるミスペア認識の特異性を解析するため、精製標品を用いて枯草菌MutS蛋白質はHeteroduplexに特異的に結合することを明らかにした。その中でも特にトランジション型の変異、一部のトランスバ-ジョン型の変異、さらに1〜2塩基のループ構造等のミスペアを特異的に認識する活性をもっていた。MgCl_2非存在下でもミスペアを認識することができるが、ATP存在下ではその活性はかなり低下した。また、枯草菌MutS蛋白質とHeteroduplexとの相互作用を解析するためにATPase活性を測定した。その結果、Heteroduplex、ミスペアを含まない二本鎖DNA基質(Homoduplex)、一本鎖DNA基質、DNA基質なしの順でATPase活性が低下した。

MUTS基因是由枯草芽孢杆菌基因组项目发现的，DNA片段通过PCR扩增以克隆MUTS基因。确定克隆的MUTS基因的整个碱基序列并确认其不含PCR误差。枯草芽孢杆菌Muts基因由T7启动子控制，大量枯草芽孢杆菌Muts蛋白具有分子量为97,500 daltons的蛋白，在大肠杆菌中表达。通过溶菌酶处理，硫酸铵沉淀，肝素塞彭糖柱和Monoq柱将基因产物纯化为几乎单一的制剂。作为用于纯化枯草芽孢杆菌Muts蛋白的测定系统，使用凝胶迁移率移位方法与包含 ^<32> p的Mistair的双链DNA底物（Heteroduplex）一起使用。为了分析枯草芽孢杆菌Muts蛋白的MispAir识别的特异性，我们证明了枯草芽孢杆菌Muts蛋白蛋白使用纯化的制剂特异性结合了异源蛋白。其中，它具有专门识别错误的活性，例如过渡型突变，某些横向突变和1-2个碱基的环结构。在没有MGCL_2的情况下，可以识别失误，但在ATP存在下它们的活性大大降低。另外，测量ATPase活性以分析枯草芽孢杆菌Muts蛋白质和异蓬链体之间的相互作用。结果，ATPase活性按以下顺序降低：杂化，双链DNA底物，无需失误（同型蛋白酶），单链DNA底物和无DNA底物。