ミスマッチ認識および修復過程の生化学的研究
错配识别和修复过程的生化研究
基本信息
- 批准号:09269220
- 负责人:
- 金额:$ 1.28万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
- 财政年份:1997
- 资助国家:日本
- 起止时间:1997 至 无数据
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
枯草菌ゲノムプロジェクトによりmutS遺伝子が見いだされたので、PCR法によりDNA断片を増幅しmutS遺伝子をクローン化した。クローン化したmutS遺伝子は全塩基配列を決定し、PCRエラーを含まないことを確認した。枯草菌mutS遺伝子をT7プロモーターの制御下におき、大腸菌内で分子量97,500ダルトンの枯草菌MutS蛋白質を大量に発現させた。その遺伝子産物をリゾチーム処理、硫安沈殿、Heparin Sepharoseカラム、MonoQカラムによってほぼ単一標品に精製した。枯草菌MutS蛋白質を精製するためのアッセイ系としては、^<32>Pでラベルしたミスペアを含む二本鎖DNA基質(Heteroduplex)によるゲルモビリティシフト法を用いた。枯草菌MutS蛋白質によるミスペア認識の特異性を解析するため、精製標品を用いて枯草菌MutS蛋白質はHeteroduplexに特異的に結合することを明らかにした。その中でも特にトランジション型の変異、一部のトランスバ-ジョン型の変異、さらに1〜2塩基のループ構造等のミスペアを特異的に認識する活性をもっていた。MgCl_2非存在下でもミスペアを認識することができるが、ATP存在下ではその活性はかなり低下した。また、枯草菌MutS蛋白質とHeteroduplexとの相互作用を解析するためにATPase活性を測定した。その結果、Heteroduplex、ミスペアを含まない二本鎖DNA基質(Homoduplex)、一本鎖DNA基質、DNA基質なしの順でATPase活性が低下した。
MUTS基因是由枯草芽孢杆菌基因组项目发现的,DNA片段通过PCR扩增以克隆MUTS基因。确定克隆的MUTS基因的整个碱基序列并确认其不含PCR误差。枯草芽孢杆菌Muts基因由T7启动子控制,大量枯草芽孢杆菌Muts蛋白具有分子量为97,500 daltons的蛋白,在大肠杆菌中表达。通过溶菌酶处理,硫酸铵沉淀,肝素塞彭糖柱和Monoq柱将基因产物纯化为几乎单一的制剂。作为用于纯化枯草芽孢杆菌Muts蛋白的测定系统,使用凝胶迁移率移位方法与包含 ^<32> p的Mistair的双链DNA底物(Heteroduplex)一起使用。为了分析枯草芽孢杆菌Muts蛋白的MispAir识别的特异性,我们证明了枯草芽孢杆菌Muts蛋白蛋白使用纯化的制剂特异性结合了异源蛋白。其中,它具有专门识别错误的活性,例如过渡型突变,某些横向突变和1-2个碱基的环结构。在没有MGCL_2的情况下,可以识别失误,但在ATP存在下它们的活性大大降低。另外,测量ATPase活性以分析枯草芽孢杆菌Muts蛋白质和异蓬链体之间的相互作用。结果,ATPase活性按以下顺序降低:杂化,双链DNA底物,无需失误(同型蛋白酶),单链DNA底物和无DNA底物。
项目成果
期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
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