ミスマッチ認識および修復過程の生化学的研究

错配识别和修复过程的生化研究

• 批准号: 09269220
• 负责人: 秋山 昌広
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09269220/
• 关键词: ミスマッチ修復; 枯草菌; 自然突然変異

枯草菌ゲノムプロジェクトによりmutS遺伝子が見いだされたので、PCR法によりDNA断片を増幅しmutS遺伝子をクローン化した。クローン化したmutS遺伝子は全塩基配列を決定し、PCRエラーを含まないことを確認した。枯草菌mutS遺伝子をT7プロモーターの制御下におき、大腸菌内で分子量97,500ダルトンの枯草菌MutS蛋白質を大量に発現させた。その遺伝子産物をリゾチーム処理、硫安沈殿、Heparin Sepharoseカラム、MonoQカラムによってほぼ単一標品に精製した。枯草菌MutS蛋白質を精製するためのアッセイ系としては、^<32>Pでラベルしたミスペアを含む二本鎖DNA基質(Heteroduplex)によるゲルモビリティシフト法を用いた。枯草菌MutS蛋白質によるミスペア認識の特異性を解析するため、精製標品を用いて枯草菌MutS蛋白質はHeteroduplexに特異的に結合することを明らかにした。その中でも特にトランジション型の変異、一部のトランスバ-ジョン型の変異、さらに1〜2塩基のループ構造等のミスペアを特異的に認識する活性をもっていた。MgCl_2非存在下でもミスペアを認識することができるが、ATP存在下ではその活性はかなり低下した。また、枯草菌MutS蛋白質とHeteroduplexとの相互作用を解析するためにATPase活性を測定した。その結果、Heteroduplex、ミスペアを含まない二本鎖DNA基質(Homoduplex)、一本鎖DNA基質、DNA基質なしの順でATPase活性が低下した。

mutS基因是通过枯草芽孢杆菌基因组计划发现的，并且通过使用PCR扩增DNA片段来克隆mutS基因。确定了克隆的mutS基因的完整核苷酸序列，并确认其不存在任何PCR错误。将枯草芽孢杆菌mutS基因置于T7启动子控制下，在大肠杆菌中大量表达分子量为97500道尔顿的枯草芽孢杆菌MutS蛋白。通过溶菌酶处理、硫酸铵沉淀、肝素琼脂糖柱和MonoQ柱将基因产物纯化至几乎单一标准。作为纯化枯草芽孢杆菌MutS蛋白的测定系统，我们使用凝胶迁移率变动法，该方法使用含有用^ 32 P标记的错配的双链DNA底物(异源双链体)。为了分析枯草芽孢杆菌MutS蛋白错配识别的特异性，我们使用纯化的制剂并揭示枯草芽孢杆菌MutS蛋白特异性结合异源双链体。其中，它具有特异性识别过渡型突变、一些颠换型突变以及1-2-碱基环结构等错配的活性。即使在没有 MgCl_2 的情况下也可以识别错配，但在 ATP 存在的情况下活性显着降低。此外，还测量了 ATPase 活性，以分析枯草芽孢杆菌 MutS 蛋白与异源双链体之间的相互作用。其结果，ATP酶活性按照异源双链体、无错配的双链DNA底物(同源双链体)、单链DNA底物、无DNA底物的顺序降低。