脊髄内痛覚伝導回路に関与する抑制性アミノ酸の役割:分子プロ-ブを用いた研究

抑制性氨基酸在椎管内疼痛传导回路中的作用：使用分子探针的研究

基本信息

批准号：
03260201
负责人：
赤木宏行
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03260201/
关键词：
痛覚脊髄グリシンレセプタ-免疫組織化学伝達物質

项目摘要

哺乳類脊髄において痛覚の制御にグリシン、GABA作動系ニュ-ロンが関与する可能性を探ることを目的として、以下の研究を行った。1.グリシン受容体サブユニット蛋白質を認識する抗体の調製痛み刺激を加えることにより脊髄のグリシン受容体量の変動を蛋白レベルで調べるために、ポリクロ-ン抗体の調製を試みた。我々のグル-プによりクロ-ン化されたグリシン受容体α1サブユニットcDNAの塩基配列から推定される蛋白の一次構造をもとにして、アミノ酸10残基からなるペプチドを合成した。これをKLHと結合したものを抗原にしてウサギに免疫した。数回の追加免疫を行った後、x10000倍の希釈率で抗原を認識する抗体が得られた。ラット脊髄の膜分画を可溶化し、ポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、ウエスタンブロットを行った結果、48kDaの位置に存在する蛋白が抗体と反応することを確認した。この蛋白はcDNAクロ-ニングの結果から予測されるサブユニット蛋白質のサイズとよく一致した。この抗体を用いて、免疫組織化学的に受容体蛋白の分布を調べる研究に着手した。2.In situ hybridizationによる受容体RNAの分布の検討1.と平行して、クロ-ン化したグリシン受容体cDNAの制限酵素切断片をプロ-ブに用い、in situ hybridization法による脊髄内mRNAの分布を検討した。痛覚と関係する一次知覚ニュ-ロン終末が局在する脊髄後角の辺縁層や膠様質層にもグリシン受容体mRNAが多量に存在することを確認した。侵害刺激を加えた後の受容体mRNAの変動について検討を開始した。

我们进行了以下研究，以探讨甘氨酸和 GABA 能神经元参与哺乳动物脊髓痛觉控制的可能性。 1. 制备识别甘氨酸受体亚基蛋白的抗体为了研究施加疼痛刺激后脊髓中甘氨酸受体数量在蛋白水平上的变化，我们尝试制备多克隆抗体。根据本课题组克隆的甘氨酸受体α1亚基cDNA的核苷酸序列推导出的蛋白质一级结构，合成了由10个氨基酸残基组成的肽。将其与 KLH 结合并用作抗原来免疫兔子。经过几次加强免疫后，获得了稀释度为 10,000 倍的识别抗原的抗体。溶解大鼠脊髓膜部分并通过聚丙烯酰胺电泳分离后，Western印迹证实48 kDa位置处存在的蛋白质与抗体发生反应。该蛋白质的大小与根据 cDNA 克隆结果预测的亚基蛋白质的大小非常匹配。使用这种抗体，我们开始通过免疫组织化学研究受体蛋白的分布。 2.通过原位杂交检查受体RNA的分布与步骤1平行，我们使用克隆的甘氨酸受体cDNA的限制性酶切片段作为探针，通过原位杂交研究了mRNA在脊髓中的分布。分布进行了检查。我们证实，甘氨酸受体 mRNA 大量存在于脊髓背角的边缘层和胶体层，其中与伤害感受相关的初级感觉神经元末梢位于此处。我们开始研究有害刺激后受体 mRNA 的变化。