Molecular mechanism of substrate selection and cleavage by intramembrane protease in lipid bilayer

脂双层膜内蛋白酶底物选择和裂解的分子机制

基本信息

批准号：
22H02561
负责人：
禾晃和
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

継続して取り組んできたRsePのX線結晶解析が完了し、大腸菌由来RseP（EcRseP）と海洋性細菌K. koreensis由来のRsePオルソログ（KkRseP）の2つのタンパク質について、いずれも阻害剤Batimastatとの複合体の構造を決定することができた。Batimastatはペプチド様の構造をとる低分子化合物であり、RsePの膜内領域に形成されたβシート（MREβ-sheet）に主鎖を介して相互作用していた。また、MREβ-sheetの反対側からAsn-394が側鎖を介してBatimastatと水素結合し、Batimastatを活性中心近傍に固定していた。Asn-394は、RsePオルソログだけでなく、S2Pファミリー全体でも保存されている残基であり、この残基に変異を導入すると、Batimastatの阻害効果と基質切断活性の両方が低下することが分かった。この変異体解析の結果は、基質タンパク質もBatimastatと同様にMREβ-sheetに結合し、Asn-394によって固定された状態で切断を受けることを強く示唆するものである。また、X線結晶解析の結果、EcRsePでは、4番目の膜貫通ヘリックス（TM4）と膜表在性ヘリックス（PCT-H2）が静電的に相互作用することが明らかになった。そして、この静電的相互作用を破壊するような変異が既知の活性変異と同等の活性の低下を引き起こすことが分かり、TM4やPCT-H2が切断制御において重要な役割を担うことが示唆された。さらに、EcRsePとKkRsePの結晶構造の比較から、これらのタンパク質は基質取り込みの過程で構造変化を起こす可能性が示された。この結果を受けて、構造変化の検証のためにクライオ電子顕微鏡による構造解析に着手することとし、RsePに対して結合する抗体の探索も行った。

正在进行的 RseP 的 X 射线晶体分析已经完成，两种蛋白，源自大肠杆菌的 RseP (EcRseP) 和源自海洋细菌 K. koreensis 的 RseP 直向同源物 (KkRseP)，已成功与抑制剂 Batimastat 缀合。能够确定身体的结构。 Batimastat是一种具有肽样结构的低分子化合物，通过其主链与RseP膜内区域形成的β-折叠（MREβ-折叠）相互作用。此外，MREβ-折叠另一侧的 Asn-394 通过侧链与 Batimastat 形成氢键，将 Batimastat 固定在活性中心附近。我们发现 Asn-394 不仅在 RseP 直向同源物中而且在整个 S2P 家族中都是保守残基，并且该残基的突变会降低 Batimastat 的抑制作用和底物裂解活性。该突变体分析的结果强烈表明，底物蛋白也像 Batimastat 一样与 MREβ-片层结合，并在被 Asn-394 固定的同时进行切割。此外，X射线晶体学显示，在EcRseP中，第四跨膜螺旋（TM4）和浅膜螺旋（PCT-H2）通过静电相互作用。他们发现破坏这种静电相互作用的突变导致与已知活性突变相当的活性降低，这表明 TM4 和 PCT-H2 在调节裂解中发挥着重要作用。此外，EcRseP和KkRseP晶体结构的比较表明，这些蛋白质在底物摄取过程中可能发生结构变化。基于这一结果，我们决定开始使用冷冻电子显微镜进行结构分析来验证结构变化，并寻找与 RseP 结合的抗体。