構造安定化変異を導入した組換えG蛋白質共役型受容体(PAR-4)の大量発現

大规模表达重组 G 蛋白偶联受体 (PAR-4)，并引入结构稳定突变

基本信息

批准号：
17770090
负责人：
禾晃和
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770090/
关键词：
膜蛋白質受容体構造解析構造生物学 G蛋白質共役型受容体結晶化

项目摘要

G蛋白質共役型受容体(GPCR)は、臨床医薬の標的分子として注目されている膜蛋白質ファミリーであり、Structure-based drug designのスローガンのもと、リガンド認識機構の解明を目指して、世界各国で立体構造解析が進められている。本研究では、GPCRファミリーの中から、血小板トロンビン受容体(PAR-4)を取り上げ、立体構造研究に向けた発現・精製システムの構築に取り組んだ。本研究の最終目的は、結晶化に使用可能な、"安定かつ高品質の"組換えPAR-4蛋白質を調製することであり、これを達成するために、PAR-4蛋白質に対して"構造安定化変異"の導入を行った。また、翻訳後修飾も含め、より正確なフォールディングをとった組換え蛋白質を生産させるべく、動物細胞発現系を用いた。構造安定化変異の導入については、1)糖鎖の除去、2)末端領域の欠失変異、3)ジスルフィド結合を形成しないフリーなシステイン残基の置換などを行い、それぞれの変異体の性質を調べた。その結果、糖鎖やカルボキシ末端の領域を除去しても、活性が保持された変異体PAR-4が発現することが明らかになり、結晶化に適した"よりコンパクトな"コンストラクトを作成できる可能性が示された。一方、システイン残基については受容体活性化に関与しているためか、システイン残基をアラニン残基などに置換すると活性が失われてしまった。大量発現系については、当初PAR-4の細胞毒性が問題となったが、誘導発現システムを使用することで、安定発現株を得ることに成功した。テトラサイクリンの添加によって発現制御を行なうシステムを用いたが、これにより一過性発現時よりも高い発現が見られる安定発現株を得ることが出来た。この後、培養、発現など各ステップの条件検討を進め、アフィニティークロマトグラフィーを用いてPAR-4蛋白質の精製に取り組んだ。

G蛋白偶联受体（GPCR）是一个膜蛋白家族，吸引着作为临床药物的靶标分子的注意力，并且在世界各国进行了3D结构分析，目的是阐明基于基于结构药物设计的口号的配体识别机制。这项研究的重点是GPCR家族的血小板凝血酶受体（PAR-4），并致力于建造用于空间结构研究的表达和纯化系统。这项研究的最终目的是准备一种可用于结晶的“稳定和高质量”重组PAR-4蛋白，为了实现这一目标，我们引入了Par-4蛋白的“稳定突变”。此外，动物细胞表达系统用于生产重组蛋白，这些蛋白质经历了更准确的折叠，包括翻译后修饰。通过1）去除糖链，2）末端区域的缺失突变进行结构稳定突变的引入，3）替换不形成二硫键的半胱氨酸残基，并检查了每个突变体的特性。结果，可以揭示即使去除糖链和羧基末端区域，表达具有保留活性的突变体Par-4，这表明可以创建适合结晶的“更紧凑”构建体。另一方面，半胱氨酸残基参与受体激活，当半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代时，它们的活性就会丢失。就大量表达系统而言，PAR-4的细胞毒性最初是一个问题，但是通过使用诱导表达系统，我们成功获得了稳定的表达菌株。使用系统通过添加四环素来控制表达，因此获得了稳定的表达应变，该表达菌株显示出比瞬时表达时更高的表达。此后，在每个步骤中研究了条件，例如培养和表达，并使用亲和色谱法进行了Par-4蛋白的纯化。