一回膜貫通型蛋白質プレキシンによるシグナル伝達機構の構造学的解明

单跨膜蛋白丛蛋白信号转导机制的结构阐明

• 批准号: 21K06166
• 负责人: 鈴木 博視
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06166/
• 关键词: シグナル伝達; 一回膜貫通型蛋白質; GTPase; クライオ電子顕微鏡; 単粒子解析; 一回膜貫通タンパク質

非常に柔軟性の高い全体構造をとるヒトセマフォリン・プレキシン複合体について、一回膜貫通タンパク質クライオ電子顕微鏡に適した試料作製法の検討を継続して続けた。主に、複数種のサブタイプについて追加のクローニングを行うとともに、発現量の向上が見られる発現細胞種（特に糖鎖付加のパターンが異なるHEK293の変異株など）、発現手法（一過性およびバキュロウイルス系）を検討した。そのうち、Expi293細胞株を使用することで多くのケースにおいて発現量の増加が見られた。発現量が少ないものについては低収量ながら純度を高められるようタグの検討も行った。これらの検討は主にゲル濾過クロマトグラフィーのチャートの高さや単分散性を指標にした。ショウジョウバエ由来遺伝子のサブタイプについて、プレキシンとセマフォリンの組み合わせによって親和性が大きく異なることが分かったため、特に親和性の高い組み合わせのサブタイプについて発現・精製の最適化をおこなった。クライオ電子顕微鏡の試料作製に関しては、脂質ナノディスク再構成系では必要なタンパク質濃度を抑えられる利点があったが、粒子の配向性に偏りが生じがちで三次元再構成が困難という問題が残るため、再構成条件やグリッド作製条件の検討を継続している。界面活性剤によるミセル中では、プレキシン二量体の安定性に問題が残るとともに、電顕グリッド中での粒子数が激減し分散が悪くなる傾向があるため、できるだけタンパク質試料が高濃度になる精製条件を、発現最適化とともに継続している。また、リポソームのような脂質環境に多数のプレキシン複合体が埋め込まれた試料作製条件も検討した。

我们继续研究一种适用于人类信号蛋白 - 杂色复合物的单跨膜蛋白冷冻电子显微镜的样品制备方法，该方法具有高度灵活的整体结构。除了对多种亚型执行其他克隆外，我们还检查了表达细胞类型（尤其是具有不同糖基化模式的HEK293的突变菌株），以及表达方法（瞬态和杆状病毒系统），这些方法显示出改善的表达水平。其中，在许多情况下，Expi293细胞系的使用显示表达水平升高。对于那些表达水平较低的人，我们还研究了标签以提高纯度，尽管产量较低。这些研究主要基于凝胶过滤色谱图的高度和单分散性。正如发现，果蝇衍生基因亚型的亲和力取决于丛蛋白和词素，表达和纯化的组合，以针对具有特别高亲和力的组合的亚型进行了优化。关于冷冻电子显微镜的样品制备，脂质纳米风险重建系统的优势是可以抑制所需的蛋白质浓度，但是问题仍然是，颗粒的方向倾向于偏置，三维重建是困难的，因此，重建条件和网格准备条件仍在继续。在带有表面活性剂的胶束中，问题与丛二聚体的稳定性保持不变，电子显微镜网格中的颗粒数量倾向于显着减少，并且分散体变得较差，因此，蛋白质样品尽可能高的纯化条件会继续进行表达优化。此外，还研究了制备样品的条件，其中还研究了许多植物复合物嵌入在脂质环境（例如脂质体）中的条件。