一回膜貫通型蛋白質プレキシンによるシグナル伝達機構の構造学的解明

单跨膜蛋白丛蛋白信号转导机制的结构阐明

• 批准号: 21K06166
• 负责人: 鈴木 博視
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06166/
• 关键词: シグナル伝達; 一回膜貫通型蛋白質; GTPase; クライオ電子顕微鏡; 単粒子解析; 一回膜貫通タンパク質

非常に柔軟性の高い全体構造をとるヒトセマフォリン・プレキシン複合体について、一回膜貫通タンパク質クライオ電子顕微鏡に適した試料作製法の検討を継続して続けた。主に、複数種のサブタイプについて追加のクローニングを行うとともに、発現量の向上が見られる発現細胞種（特に糖鎖付加のパターンが異なるHEK293の変異株など）、発現手法（一過性およびバキュロウイルス系）を検討した。そのうち、Expi293細胞株を使用することで多くのケースにおいて発現量の増加が見られた。発現量が少ないものについては低収量ながら純度を高められるようタグの検討も行った。これらの検討は主にゲル濾過クロマトグラフィーのチャートの高さや単分散性を指標にした。ショウジョウバエ由来遺伝子のサブタイプについて、プレキシンとセマフォリンの組み合わせによって親和性が大きく異なることが分かったため、特に親和性の高い組み合わせのサブタイプについて発現・精製の最適化をおこなった。クライオ電子顕微鏡の試料作製に関しては、脂質ナノディスク再構成系では必要なタンパク質濃度を抑えられる利点があったが、粒子の配向性に偏りが生じがちで三次元再構成が困難という問題が残るため、再構成条件やグリッド作製条件の検討を継続している。界面活性剤によるミセル中では、プレキシン二量体の安定性に問題が残るとともに、電顕グリッド中での粒子数が激減し分散が悪くなる傾向があるため、できるだけタンパク質試料が高濃度になる精製条件を、発現最適化とともに継続している。また、リポソームのような脂質環境に多数のプレキシン複合体が埋め込まれた試料作製条件も検討した。

对于具有高度灵活整体结构的人脑信号蛋白-丛蛋白复合物，我们继续研究适合单跨膜蛋白冷冻电镜的样品制备方法。主要是，我们将对多种亚型以及表达水平提高的表达细胞类型（特别是具有不同糖基化模式的 HEK293 突变体）和表达方法（瞬时和杆状转移病毒）进行额外的克隆。其中，通过使用Expi293细胞系，在许多情况下观察到表达水平的增加。对于低表达水平的产品，我们还研究了标签以提高纯度，尽管产量较低。这些研究主要以凝胶过滤色谱图高度和单分散性为指标。由于我们发现果蝇来源的基因亚型的亲和力根据丛蛋白和信号蛋白的组合而有很大差异，因此我们优化了具有特别高亲和力组合的亚型的表达和纯化。对于冷冻电子显微镜的样品制备，脂质纳米盘重建系统具有降低所需蛋白质浓度的优点，但问题仍然是颗粒的方向容易出现偏差，使得三维重建变得困难。研究重建条件和网格制作条件。在使用表面活性剂的胶束中，丛蛋白二聚体的稳定性仍然存在问题，并且电子显微镜网格中的颗粒数量趋于急剧减少，导致分散不良。条件仍在继续进行表达优化。我们还研究了将多个丛蛋白复合物嵌入脂质环境（例如脂质体）中的样品制备条件。