癌の発生と悪性進展における低酸素応答機構と癌抑制機構のクロストークの役割

缺氧反应机制与抑癌机制之间的串扰在癌症发生和恶性进展中的作用

基本信息

批准号：
16H06891
负责人：
子安翔
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-08-26 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16H06891/
关键词：
腫瘍低酸素 HIF-1 p53 悪性腫瘍

项目摘要

まず、HPF-4がHIF-1を活性化するメカニズムとして、HIF-1αのタンパク量への影響をウエスタンブロッティングで検討した。HPF-4の過剰発現によってHIF-1αのタンパク量は変化しなかった。次に、HPF-4がHIF-1αのtransactivation 活性に影響を及ぼすかどうかを検討するためにGal4DBDにHIF-1αの転写活性部の様々なdeletion mutant を連結させた融合タンパクを作成し、E1b Luciferase を用いてHIF-1の転写活性を発光量で検出することができるシステムを作成し、検証したところ、HIF-1αの二か所の transactivation domain についてHPF-4が活性の上昇をもたらすことが確認できた。また、共免疫沈降法で、HPF-4とHIF-1αのinteraction があることを示唆する結果を得た。次に、HPF-4の活性部位の同定を行うために、各ドメインのdeletion mutant 等を用いて上述の活性化の有無を調べたところ、5つあるドメイン中、3つのドメインを除去したmutant では活性が失われることが分かった。さらに、p53 がどのレベルでHPF-4の活性を抑制するかをメカニズムの異なるp53 の変異タンパクを用いて検証した。p53の変異体のうち、立体構造の異なるもの（R175H）、立体構造は同一であるがDNAへの結合能を持たないもの（R248W）、DNAへの結合はあるが転写活性を持たない4アミノ酸置換の変異体（Cell 145, 571:2011）のいずれもHPF-4の抑制能力を持たなかったことから、p53の直接のinteraction というよりは、下流遺伝子が関与していることが考えられた。

首先，作为HPF-4激活HIF-1的机制，我们通过Western blotting检测了其对HIF-1α蛋白水平的影响。 HPF-4的过表达并没有改变HIF-1α的蛋白水平。接下来，为了检查 HPF-4 是否影响 HIF-1α 的反式激活活性，我们创建了一个融合蛋白，其中 HIF-1α 转录激活区域的各种缺失突变体与 Gal4DBD 连接，并验证了一个系统。通过发光量可以检测HIF-1的转录活性，我们发现HIF-1α的两个反式激活结构域已证实 HPF-4 导致的活性增加。此外，免疫共沉淀结果表明HPF-4和HIF-1α之间存在相互作用。接下来，为了鉴定HPF-4的活性位点，我们使用各结构域的缺失突变体研究了上述激活的存在与否，结果发现活性丧失。此外，我们使用具有不同机制的 p53 突变蛋白检查了 p53 抑制 HPF-4 活性的水平。 p53变体中，一种具有不同的三维结构（R175H），一种具有相同的三维结构但不具有与DNA结合的能力（R248W），以及4个与DNA结合但不具有结合能力的氨基酸。没有一个取代突变体 (Cell 145, 571:2011) 具有抑制 HPF-4 的能力，表明与 p53 存在直接相互作用。相反，人们认为下游基因参与其中。