癌細胞の低酸素応答と放射線抵抗性を担う新規遺伝子の機能解析と治療・画像化への展開

负责癌细胞缺氧反应和放射抗性的新基因的功能分析以及治疗和成像的开发

基本信息

批准号：
17J07699
负责人：
子安翔
金额：
$ 7.49万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J07699/
关键词：
悪性腫瘍浸潤低酸素 HIF-1 転写因子腫瘍がん抑制遺伝子

项目摘要

まず、HPF-4のN末端部で、二量体形成に重要なドメインを同定した。HPF-4と相同性の高いhMN (human myeloneurin) というタンパクがすでに結晶構造を解析できるため、ホモロジーモデリングの手法を用いて、HPF-4での構造を推定し、二量体形成に重要であろうアミノ酸として、8-11 番目のアミノ酸残基に着目した。同部位をアラニンで置換した変異体タンパク（HPF-4 4A）をコードするプラスミドを作成して、共免疫沈降法およびHIF-1の転写活性化能を評価するレポーター遺伝子をもちいて検証したところ同アラニン置換変異体は二量体を形成することができず、その結果HIF-1活性化能も持たないことが確認できた。レンチウイルスを用いてHPF-4 4AをHCT116 p53 欠失株に安定的に導入した癌細胞を樹立し、同細胞を免疫不全マウスに移植して作成した腫瘍を用いて腫瘍増大速度を野生型HPF-4と比較したところ、4A変異体はコントロールベクターのみ導入した細胞と同程度の腫瘍増大速度であり、野生型で見られる増大速度の上昇は見られなかった。次に、HPF-4に結合して、その活性を阻害する化合物の設計を以下の二種類の方法で試みた。A.様々な長さでC末端を欠失させた変異体を作成するプラスミドを作成し、それらを細胞に導入してタンパク発現させ、そのうちから結合阻害活性を持つものをスクリーニングした。B. MD計算で、野生型タンパク（homodimer を形成可能）と、４アミノ酸のアラニン置換体（homodimer を形成不可能）とで、安定性の変化するアミノ酸領域を同定する。その結果を踏まえ、N末端部と同一の配列を持つポリペプタイドを作成した。結果、両方の方法で、野生型HPF-4を阻害する化合物のモデルを得ることができた。

首先，我们确定了 HPF-4 N 末端二聚体形成的重要结构域。由于与 HPF-4 高度同源的 hMN（人髓神经元）蛋白质的晶体结构已经被分析，因此我们使用同源建模方法来估计 HPF-4 的结构，这对于二聚体的形成很重要。我们重点关注氨基酸残基 8-11 作为蜡质氨基酸。制作编码同一位点被丙氨酸取代的突变体蛋白(HPF-4 4A)的质粒，通过免疫共沉淀和报告基因进行验证，评价HIF-1转录激活能力，确认了丙氨酸取代突变体。无法形成二聚体，因此不具备激活 HIF-1 的能力。我们使用慢病毒将HPF-4 4A稳定导入HCT116 p53缺失株中建立了癌细胞，并将相同的细胞移植到免疫缺陷小鼠体内以产生肿瘤。将肿瘤生长速度与野生型HPF-4进行比较。，4A突变体的肿瘤生长速率与仅引入对照载体的细胞的肿瘤生长速率相当，并且没有观察到野生型中观察到的生长速率的增加。接下来，我们尝试使用以下两种方法设计一种与 HPF-4 结合并抑制其活性的化合物。答：我们创建了质粒来创建具有不同长度的 C 端缺失的突变体，将它们引入细胞中，表达蛋白质，并筛选具有结合抑制活性的突变体。 B.MD计算确定了野生型蛋白质（能够形成同型二聚体）和4-氨基酸丙氨酸取代的蛋白质（能够形成同型二聚体）之间稳定性变化的氨基酸区域。根据结果，我们创建了与 N 末端序列相同的多肽。结果，使用这两种方法，我们能够获得抑制野生型 HPF-4 的模型化合物。