ヒストンH2AX複合体のプロテオミクス解析による放射線ゲノム損傷の修復機構の解明

通过组蛋白H2AX复合物的蛋白质组学分析阐明辐射基因组损伤的修复机制

• 批准号: 15651020
• 负责人: 神谷 研二
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15651020/
• 关键词: ヒストンH2AX; ゲノム損傷応答; ゲノム障害; 放射線; 機能的蛋白質複合体; クロマチン; プロテオミクス; 修復蛋白質; 修復機構; MS; MS解析

放射線によるゲノム障害に対する損傷応答や修復機構には,機能的蛋白質複合体が大きく関与している。その中でヒストンH2AXは,重要な役割をなすと推定されているが,それを解析するには,H2AXの機能的蛋白質複合体の網羅的解析が必要である。本研究では,ハーバード大学中谷が開発した機能的蛋白質複合体の精製法を応用し,tagを付与したH2AX蛋白質複合体を培養細胞,及びトランスジェニックマウスを用いて,生理的条件下でのH2AX機能的蛋白質複合体の精製法を開発し,その網羅的MS/MS解析を行った。今年度は,培養細胞からのH2AX複合体の精製とその機能解析について報告する。HeLa培養細胞にクローニングしたマウスH2AXをレトロウイルスを用いて導入し,安定形質株を樹立した。この細胞株より核分画を調整し,核抽出分画およびクロマチン分画においてH2AX複合体を精製した。H2AXを標識することにより2重鎖切断後のH2AX複合体の動態を解析した。その結果,H2AX複合体はゲノム損傷部位で高度に動的な状態にあることが判明した。このH2AXの動態は,損傷後のリン酸化とは関係なくモノユビキチン化に依存しており,このユビキチン化は,TIP60ヒストン・アセチラーゼによるアセチル化により制御されていた。一方,MS解析の結果,ヒストンH2AXは損傷依存的にTIP60ヒストンアセチル化酵素に結合し,損傷に伴いアセチル化されることが判明した。このアセチル化は,TIP60ノックダウン細胞では抑制されることからTIP60ヒストンアセチル化酵素が損傷依存的にヒストンH2AXのアセチル化を制御していることが示された。この様にH2AX複合体の動態は,ゲノム損傷後のH2AXのアセチル化とモノユビキチン化により制御されており,今まで不明であったゲノム損傷初期のクロマチン・ダイナミズムと細胞応答に重要な役割をなすものであることが推定された。

功能性蛋白质复合物与辐射诱导的基因组损伤的损伤反应和修复机制很大程度上涉及。其中，估计组蛋白H2AX起着重要作用，并且为了分析它，对H2AX的功能蛋白复合物进行了详尽的分析。在这项研究中，开发了一种用于纯化哈佛大学中纳卡塔尼开发的功能性蛋白质复合物的方法，以开发一种使用培养的细胞和转基因小鼠在生理条件下纯化H2AX功能性蛋白质复合物，并使用TAG-共轭H2AX蛋白质复合物，并进行了全面的MS/MS/MS分析。今年，我们将报告培养细胞及其功能分析的H2AX复合物的纯化。用逆转录病毒引入了克隆到HeLa培养细胞中的小鼠H2AX以建立稳定的血浆。从该细胞系制备了核部分，并在核提取和染色质分数中纯化H2AX复合物。双链断裂后H2AX复合物的动力学通过用H2AX标记分析。结果表明，H2AX复合物在基因组损伤部位高度动态。该H2AX的动力学取决于单次泛素化，与伤害后磷酸化无关，这是由TIP60组蛋白乙酰基酶调节的。另一方面，MS分析表明，组蛋白H2AX以损伤依赖性方式与TIP60组蛋白乙酰酶结合，并用损伤为乙酰化。该乙酰化在TIP60敲低细胞中抑制，表明TIP60组蛋白乙酰酶以损伤依赖性方式调节组蛋白H2AX乙酰化。因此，据估计，基因组损伤后H2AX的H2AX复合物的动力学受到H2AX的单次化调节，并且在基因组损伤的早期阶段的染色质动力学和细胞反应中起着重要作用，此前尚不清楚。

项目成果

The First US-Japan Meeting on Error-Prone DNA Synthesis

首次美日关于容易出错的 DNA 合成会议

• 发表时间: 2005
• 期刊: DNA Repair 4・6
• 作者: Kamath-Loeb;A.
• 通讯作者: A.

黒川 清: "内科学 II"文光堂. 2580 (2003)

黑川清：《内科 II》文科堂 2580 (2003)。

The first US-Japan meeting on error-prone DNA synthesis, Maui, Hawaii, December 20-21, 2004.

第一次美日关于易错 DNA 合成的会议，夏威夷毛伊岛，2004 年 12 月 20 日至 21 日。

• 发表时间: 2005
• 期刊: DNA Repair 4(6)
• 作者: Kamath-Loeb;AS.
• 通讯作者: AS.

Masuda, Y.: "Structure and enzymatic properties of a stable complex of the human REV1 and REV7 proteins"J.Biol.Chem.. 278・14. 12356-12360 (2003)

Masuda, Y.：“人 REV1 和 REV7 蛋白的稳定复合物的结构和酶特性”J.Biol.Chem.. 278・14 (2003)。

新世紀の緊急被ばく医学

新世纪的应急放射医学

• 发表时间: 2004
• 期刊: 広島医学 57・4 Suppl.
• 作者: Mochizuki;H.;神谷研二;増田雄司;神谷研二
• 通讯作者: 神谷研二