損傷センサー複合体9-1-1とMRNを介した新規DNA二重鎖切断応答機構の解明

阐明损伤传感器复合物 9-1-1 和 MRN 介导的新型 DNA 双链断裂响应机制

基本信息

批准号：
21J14041
负责人：
達川絢介
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA二重鎖切断（DSB）はDSBはDNA損傷チェックポイント機構によって検知され、その下流でDNA修復や細胞周期の停止を制御する。チェックポイント機構はDNA損傷の構造によって使い分けられており、DSB末端を検出する経路と、一本鎖DNAの露出を検出する経路がある。DSBはいくつかの機構で修復されるが、相同な配列を利用する修復は正確性が高く重要な修復機構である。この反応には、DSB末端を削り込み、一本鎖を露出させる必要がある。チェックポイントはこのようなダイナミックなDNA構造の変化中も損傷を検知し続ける。本研究では、DSB末端を検知するMre11-Rad50-Nbs1（MRN）、一本鎖DNAの露出を検知するRad9-Hus1-Rad1（9-1-1）の2種類の損傷センサー複合体が、DSBに対してそれぞれ独立して重複して機能するという結果を元に、DSB時の損傷応答の解明を目指した。本年度は、DSBを模したDNAが結合した担体を作成し、これをカエル卵抽出液中（NPE）で反応させてプルダウンを行うことで、基質DNAの状態とDNAに結合したタンパク質を解析できる実験系を構築した。この実験系を用いて二種類の損傷センサーである9-1-1、MRNがそれぞれ単独で働く条件下でのDSB関連因子について経時的な変化を解析した。これら二つの因子がATR活性化因子のリクルートに重複して寄与すること、また、一方の因子のみがDSB末端削り込みヌクレアーゼの呼び込みに働くことを示した。さらに、センサータンパク質以外の因子についてもNPE中から除去して解析を行い、DSB関連因子のDNA結合動体を捉えることができた。今後、このプルダウン系と質量分析などの網羅的な解析を組み合わせることで、様々なタンパク質が働き、多様な反応が起きるDSB時DNA上でのタンパク質の反応ネットワークが明らかになることが期待される。

DNA双链切割（DSB）由DNA损伤检查点机制检测到，DNA恢复和细胞周期停止在下游中受到控制。根据DNA损伤的结构，检查点机制的使用方式不同，并且有用于检测DSB端的途径，以及检测单个链式DNA暴露的途径。 DSB通过多种机制恢复，但是使用局部阵列的恢复是一种高度准确且重要的修复机制。在此反应中，需要锐化DSB端子，并暴露了一个单链链。检查点在改变动态DNA结构时继续检测损伤。在这项研究中，检测DSB末端的两种类型的损伤传感器复合物MRE11-RAD50-NBS1（MRN），Rad9-Hus1-Rad1（9-1-1）（9-1-1）（9-1-1）检测基于重复和重复的功能的单链DNA的暴露，旨在阐明DSB期间的损伤响应。在这个财政年度，模仿DSB的DNA会产生一个结合载体，这是一种可以在底物DNA的状态和DNA结合蛋白中分析的反应，通过在青蛙蛋萃取（NPE）中反应系统。使用此实验系统，在MRN单独工作的条件下，随着时间的推移将两种类型的损伤传感器分析为与DSB相关的因素。它表明，这两个因素有助于募集ATR激活因子，并且只有一个因素适用于DSB末端 - 触发核。此外，在NPE期间从传感器较小以外的因子除去并进行了分析，并可以捕获与DSB相关因子的DNA结合体。将来，通过结合这种拉动系统和诸如质谱等综合分析，可以预期各种蛋白质将起作用，并且会揭示出发生各种反应的DNA上蛋白质的反应网络。