DNA損傷応答時に相同組換え修復が担うゲノム安定化機構の解明

阐明DNA损伤反应过程中同源重组修复发挥的基因组稳定机制

基本信息

批准号：
22K18036
负责人：
藤田侑里香
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18036/
关键词：
相同組換え DNA損傷染色体がん

项目摘要

本年度はHR関連因子、特に正と負に制御する因子のそれぞれの機能や関係性を明らかにすることを主眼において、作製済みの変異体細胞の解析を中心に行った。また、変異体解析が困難な遺伝子については、siRNA処理により遺伝子を欠損させた後の細胞の、RAD51の局在やDNA損傷の蓄積状況など、表現型解析を行なった。今後タンパク間の相互作用などを検証していく予定である。合わせて、HR因子が機能するDNA複製期（S期）に特に焦点を当て、S期の染色像からS期を前期・中期・後期に分類し、各HR因子の変異体・欠損細胞でRAD51等、HRやDNA複製に関与する因子についてを免疫染色で検証した結果、因子によって主に機能するphaseが異なる可能性が確認された。ただし本年度の検討では各分類における細胞の絶対数に偏りがあることやDNA損傷有無における差異まで比較することができなかったため、来年度以降は細胞の同調やFACSソーティング等を活用して再現性を確認する。さらに、HR関連因子が機能する染色体上の特異性をゲノムワイドに検証するため、RAD51のChIP-seqの条件検討を実施した。RAD51は染色体上における局在が一時的であること等から初回のChIP-seqでは十分なピーク検出は困難であったが、細胞数やリード数などの条件等を行なった結果、DNA損傷下においてRAD51のピークを検出することができ、未処理群と比較してRAD51の結合量及び局在場所に顕著な差異が確認された。この結果を受けて、再現性の確認及び種類の異なる薬剤処理を実施後にChIP-seqを追加実施済みで、現在解析を行っている。

今年，我们重点分析生成的突变细胞，重点是阐明 HR 相关因子的功能和关系，特别是那些对其进行正向和负向调节的因子。此外，对于突变分析困难的基因，我们对通过siRNA处理进行基因删除后的RAD51定位和细胞中DNA损伤积累进行了表型分析。未来，我们计划检查蛋白质之间的相互作用。此外，我们特别关注HR因子发挥作用的DNA复制期（S期），根据S期的染色图像将S期分为早期、中期和晚期，并在突变/缺陷细胞中检测到RAD51使用免疫染色检查与HR和DNA复制相关的因素，结果确认主要功能阶段可能因因素而异。然而，在今年的研究中，每个分类的细胞绝对数量存在偏差，无法比较DNA损伤有无的差异，因此从明年开始，我们将使用细胞来确认再现性同步和FACS分选。此外，为了在全基因组范围内验证 HR 相关因子发挥作用的染色体特异性，我们检查了 RAD51 的 ChIP-seq 条件。由于 RAD51 暂时定位在染色体上，因此在最初的 ChIP-seq 中很难充分检测到 RAD51 的峰值，但通过调整细胞数和 read 数等条件，我们发现 RAD51 的峰值可以检测到，并且与未处理组相比，RAD51的结合量和定位位置被证实有显着差异。基于这一结果，我们已经确认了重现性，并在使用不同类型的药物治疗后进行了额外的 ChIP-seq，目前正在进行分析。