リーシュマニアの新しいP-糖タンパク質の構造と機能に関する研究

利什曼原虫新型P-糖蛋白的结构与功能研究

基本信息

批准号：
07670293
负责人：
片倉賢
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

P-糖タンパク質は、ATP結合領域をもつ膜輸送タンパク質であり、リーシュマニアの薬剤耐性の分子機構において中心的役割を果たしていることが最近の研究によって明らかになってきている。これまで2つの異なるタイプのP-糖タンパク質遺伝子がリーシュマニアから単離されているが、今回、これらとは異なる新しいタイプのP-糖タンパク質遺伝子と考えられる遺伝子をクローニングし、その全塩基配列を決定した。まず、L. amazonensisのDNAを材料として、P-糖タンパク質遺伝子群に共通なATP結合領域をPCR法で増幅した。次いで、この断片をプローブとしてλGEM-11ゲノムライブラリーをスクリーニングし、得られた陽性ファージをサブクローニングしたのち、プライマーウォーキング法によってオープンリーディングフレーム(ORF)の塩基配列を決定した。ORFは3801塩基対からなり、推定される1267のアミノ酸配列は、2つのATP結合領域をもつ膜貫通型のP-糖タンパク質遺伝子機構を示した。ヒトのP-糖タンパク質遺伝子MDR1(1280残基)とのアミノ酸ホモロジーは39%であり、リーシュマニアの既知のP-糖タンパク質遺伝子であるldmdr1(1341残基)およびltpgpA(1548残基)とのホモロジーは47%および29%であった。また、サザンハイブリダイゼイションによる解析の結果、この遺伝子は単一遺伝子であるものと考えられた。以上の結果から、今回クローニングした遺伝子は、リーシュマニアの新しいタイプのP-糖タンパク質遺伝子である可能性が強く示唆された。現在、本遺伝子を発現ベクターに組み込み、リーシュマニア細胞内で発現させることにより、その機能を明らかにする実験を進めている。

P-糖蛋白是一种具有ATP结合域的膜转运蛋白，最近的研究表明，它在利什曼原虫耐药的分子机制中发挥着核心作用。到目前为止，已经从利什曼原虫中分离出两种不同类型的P-糖蛋白基因，但这次我们克隆了一种被认为是新型P-糖蛋白基因的基因，并确定了其完整的碱基序列。首先，使用亚马逊乳杆菌DNA作为材料，通过PCR扩增P-糖蛋白基因组共有的ATP结合区域。接下来，使用该片段作为探针筛选λGEM-11基因组文库，对所得阳性噬菌体进行亚克隆，并通过引物步移法确定开放阅读框（ORF）的核苷酸序列。 ORF由3801个碱基对组成，推导的1267个氨基酸序列表明具有两个ATP结合区的跨膜P-糖蛋白基因机制。与人P-糖蛋白基因MDR1(1280个残基)的氨基酸同源性为39%，与已知的利什曼原虫P-糖蛋白基因ldmdr1(1341个残基)和ltpgpA(1548个残基)的同源性分别为47%和29%。另外，根据Southern杂交分析的结果，该基因被认为是单一基因。上述结果有力地表明，本次克隆的基因可能是一种新型的利什曼原虫P-糖蛋白基因。我们目前正在进行实验，通过将该基因整合到表达载体中并在利什曼原虫细胞中表达来阐明其功能。