ポリADPリボシル化修飾による染色体分配の制御

通过聚 ADP 核糖基化修饰控制染色体分离

基本信息

批准号：
18657064
负责人：
広田亨
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ポリADPリボシル(PAR)化修飾が分裂期スピンドルの制御における重要性を明らかにすることを目的とした。先ず、PAR化修飾特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによりPAR修飾を受けたタンパク質をスメア状に検出することに成功し、このPARスメアが分裂期では間期と比し約8倍に上昇することを見出した。この抗体を用いて細胞染色を行うと、紡錘体極、紡錘体、動原体が特異的に染色され、分裂装置にPAR化修飾を受けるタンパク質が分布することが示唆された。次いで、分裂期PAR修飾を触媒するPARPを明らかにするために、候補となるPARP酵素に対してRNAiをおこない、PAR化タンパク質の変化を検討した。その結果、TankyraseというPARPをノックダウンすると分裂期微小管の動態に異常を来すことが判明した。つまり、Tankyraseのノックダウンした細胞では、紡錘体の形態が崩れ、正常に機能できないため、染色体は両方構成を獲得しないまま分裂期に停滞する。興味深いことに、Tankyraseのノックダウン細胞におけるPAR化修飾の変化を調べたところPAR化修飾の総量には大きな変化は見られず、紡錘体極と紡錘体のPAR化修飾は観察できたものの、動原体のそれは有意に低下していた。このことより、Tankyraseが動原体のタンパク質のPAR化修飾を特異的に触媒し、動原体の機能、ひいては紡錘体の機能に重要な役割を担っている可能性があると考えられ、現在、動原体におけるPAR化基質の同定を試みている。また不思議なことに、Tankyraseのノックダウン細胞では姉妹染色分体の早期分離を起こすが、紡錘体チェックポイントとコヒーシンの解離との関連性についても詳細に調べている。

在本研究中，我们旨在阐明聚ADP-核糖基（PAR）修饰在调节有丝分裂纺锤体中的重要性。首先，我们使用 PAR 修饰特异性抗体通过蛋白质印迹成功检测到涂片状形式的 PAR 修饰蛋白，与我发现的相比，这种 PAR 涂片在有丝分裂期间增加了大约 8 倍。当细胞用该抗体染色时，纺锤体极、纺锤体和动粒被特异性染色，表明经过 PAR 修饰的蛋白质分布在分裂装置中。接下来，为了阐明催化有丝分裂 PAR 修饰的 PARP，我们对候选 PARP 酶进行了 RNAi 并检查了 PAR 化蛋白质的变化。结果发现，敲除称为端锚聚合酶（Tankyrase）的 PARP 会导致有丝分裂微管动力学异常。换句话说，在端锚聚合酶被敲低的细胞中，纺锤体形状被破坏，无法正常发挥作用，导致染色体停滞在有丝分裂期，而无法获得两种构型。有趣的是，当我们检查端锚聚合酶敲低细胞中PARylation的变化时，我们发现PARylation的总量没有显着变化，尽管我们可以在纺锤体极和纺锤体上观察到PARylation，但与原始产物相比却显着降低。这表明端锚聚合酶特异性催化着丝粒蛋白的 PAR 修饰，并且可能在着丝粒的功能以及纺锤体的功能中发挥重要作用，试图识别着丝粒的 PARylation 底物。此外，神秘的是，端锚聚合酶被敲低的细胞会导致姐妹染色单体过早分离，我们也在详细研究纺锤体检查点和粘连蛋白解离之间的关系。