FRETを用いたアンジオテンシンII受容体シグナル可視化の試み

尝试使用 FRET 可视化血管紧张素 II 受体信号

• 批准号: 17659227
• 负责人: 塩島 一朗
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659227/
• 关键词: 心不全; アンジオテンシンII; 心肥大; FRET

アンジオテンシンII(AII)シグナルは心不全の病態生理において極めて重要な意義を持つ.我々は,心筋細胞の伸展刺激によりリガンドであるAIIが存在しなくてもAT1受容体活性化が生じることを見いだした[Nat Cell Biol 2004;6:499).伸展刺激によるAII非依存性のAT1受容体活性化がどのような機序でおこり,どのように心不全発症に関与しているのかについては現時点では不明である.そこで本研究では,FRETの技術を用いてAT1受容体シグナルを可視化し,さらにそれを利用して心不全発症機構の解析を行うことをその日的とした.FRETプローブの作成には,黄色の蛍光を発するYFP(yellow fluorescence protein)および青色の蛍光を発するCFP(cyan fluorescence protein)の2種類の蛍光蛋白を同一分子内に人為的に組み込む必要がある.これを433nmで励起すると,YFPとCFPが物理的に離れた場所にある場合はCFPが励起され青色の蛍光を発するのに対して,YFPとCFPが近接して存在する場合にはCFPが励起されて発する蛍光によってさらにYFPが励起され,黄色の蛍光が得られる(FRET現象).AT1受容体のようなG蛋白質共役型受容体の場合は,活性化によって第3細胞内ドメインがC末細胞内ドメインから離れるように構造変化が起こると考えられているので,第3細胞内ドメインおよびC末細胞内ドメインにそれぞれYFPとCFPを組み込むと,受容体活性化によってFRETが減弱すると考えられる.平成17年度には通常の方法でFRETプローブの作製を試みたが,高いFRET効率が得られるプローブが作製できず,平成18年度はさらにYFPとCFPを入れ替える,あるいは,YFPやCFPの前後に数アミノ酸のspacerを挿入するなどの改変を行った.FRET効率に若干の改善が認められたものの残念ながらAT1活性化を画像化するのに十分なFRETプローブは得られなかった.今後は2分子FRETなど異なる機序によるAT1活性化を画像化を目指して研究を進めていきたい.

血管紧张素 II (AII) 信号传导在心力衰竭的病理生理学中具有极其重要的意义，我们发现即使在没有配体 AII 的情况下，刺激心肌细胞拉伸也会导致 AT1 受体激活 [Nat Cell Biol]。 2004;6:499）。目前，尚不清楚拉伸刺激导致不依赖于 AII 的 AT1 受体激活的机制以及它如何参与心力衰竭的发展。今天的目标是利用 FRET 技术可视化 AT1 受体信号，并用它来分析心力衰竭的发病机制。为了创建 FRET 探针，我们使用了 YFP（黄色），它会发出黄色荧光。荧光蛋白）和CFP（青色荧光），发出蓝色荧光。需要人为地将两种类型的荧光蛋白（蛋白质）结合到同一分子中，当在433 nm处激发时，如果YFP和CFP物理分离，则CFP将被激发并发出蓝色荧光。 YFP和CFP距离很近，CFP被荧光激发而发射。这进一步激发YFP，产生黄色荧光（FRET现象）。对于G蛋白偶联受体，例如AT1受体，激活导致第三胞内结构域与C端胞内结构域分离。当它们分开时会发生变化，因此第三胞内结构域和C端胞内结构域也发生相应的结构变化。分别掺入YFP和CFP被认为通过受体激活来减弱FRET。2005年，我们尝试使用传统方法创建FRET探针，但我们无法创建能够提供高FRET效率的探针，2006财年，我们将进一步取代YFP和CFP，或者取代YFP和CFP。后来，我们进行了一些修改，例如插入几个氨基酸的间隔区，尽管观察到 FRET 效率略有提高，但遗憾的是我们无法获得足够的 FRET 探针来成像 AT1 激活，我们希望继续我们的研究。通过分子 FRET 等不同机制对 AT1 激活进行成像。

项目成果

The FOX03a Transcription Factor Regulates Cardiac Myocyte Size Downstream of AKT Signaling

FOX03a 转录因子调节 AKT 信号下游的心肌细胞大小

• 发表时间: 2005
• 期刊: Journal of Biological Chemistry 280
• 作者: Kawamura-T;Ono-K;Hasegawa-K et al.;Mukai Y et al.;Skurk C et al.
• 通讯作者: Skurk C et al.

Akt FOX03a signaling modulates the endothelial stress response through regulation of heat shock protein 70 expression

Akt FOX03a 信号通过调节热休克蛋白 70 表达来调节内皮应激反应

• 发表时间: 2005
• 期刊: FASEB Journal 19
• 作者: Kawamura-T;Ono-K;Hasegawa-K et al.;Mukai Y et al.;Skurk C et al.;Shiojima I et al.;Kim HS et al.
• 通讯作者: Kim HS et al.

Decreased vascular lesion formation in mice with inducible endothelial-specific expression of protein kinase Akt

• DOI: 10.1172/jci26223
• 发表时间: 2006-02-01
• 期刊: JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION
• 影响因子: 15.9
• 作者: Mukai, Y;Rikitake, Y;Liao, JK
• 通讯作者: Liao, JK

Disruption of coordinated cardiac hypertrophy and angiogenesis contributes to the transition to heart failure

• DOI: 10.1172/jci24682
• 发表时间: 2005-08-01
• 期刊: JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION
• 影响因子: 15.9
• 作者: Shiojima, I;Sato, K;Walsh, K
• 通讯作者: Walsh, K

Promotion of cardiac regeneration by cardiac stem cells

• DOI: 10.1161/01.res.0000186191.28820.34
• 发表时间: 2005-09-30
• 期刊: CIRCULATION RESEARCH
• 影响因子: 20.1
• 作者: Nagai, T;Shiojima, I;Komuro, I
• 通讯作者: Komuro, I