水素を含めたタンパク質の超精密立体構造研究

含氢蛋白质超精密三维结构研究

• 批准号: 17659011
• 负责人: 中津 亨
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659011/
• 关键词: エンドポリガラクツロナーゼ; 水素; X線結晶構造解析; 原子分解能; グリコシダーゼ; 一般酸-塩基触媒; 中性子結晶構造解析

一般酸-塩基触媒機構によって触媒される酵素エンドポリガラクツロナーゼの基質認識機構を解明するため、部位特異的変異、各種リガンドを導入した種々の結晶構造の解析を行った。リガンドを含まない天然型酵素の立体構造を0.75Åの原子分解能で決定した。前年度、構造決定した反応生成物ガラクツロン酸との複合体と比較した結果、活性中心の還元末端側のサブサイト+1に結合したガラクツロン酸の3位の水酸基と水素結合するAsn91が存在するループの構造が大きく異なっていた。また、ガラクツロン酸(GalA)のカルボン酸部分を認識するArg226とTyr262の側鎖に構造変化が見られ、これらの構造変化が基質の認識に重要であると考えられた。さらに、酵素基質複合体の構造を解明するため、一般酸触媒であるAsp173を置換したD173N変異体と基質ガラクツロン酸6量体との複合体の結晶構造解析を1.15Å分解能で行った。その結果、活性中心の非還元末端側は4残基分の基質結合サブサイトが存在することが確認できた。また、サブサイト+1のGalA残基の3位の水酸基はAsn91と水素結合せず、Asn91付近のループは天然型酵素単体の構造に類似していた。さらに、一般塩基触媒残基の候補であるAsp153を置換したD153N変異体と基質の複合体の結晶構造を0.85Å分解能で決定し、D173N複合体の構造と比較した。その結果、D153N複合体では、サブサイト+1のGalA残基の3位の水酸基はAsn91と水素結合し、Asn91付近のループ構造は、天然型酵素と生成物GalAとの複合体構造類似していた。このことから、一般酸触媒Asp173とグリコシド酸素との水素結合が基質の正確な認識に必須であることが確認できた。

为了阐明由一般酸碱催化机制催化的内聚半乳糖醛酸酶的底物识别机制，我们分析了具有位点特异性突变的各种晶体结构和引入的各种配体。没有配体的天然酶的三维结构以 0.75 Å 的原子分辨率测定。与前一年确定结构的反应产物半乳糖醛酸的配合物进行比较，结果发现环中含有Asn91，该Asn91与半乳糖醛酸3位上的羟基形成氢键，与子位点结合+1在活性中心结构的还原端侧显着不同。此外，在识别半乳糖醛酸（GalA）的羧酸部分的Arg226和Tyr262的侧链中观察到结构变化，并且这些结构变化被认为对于底物识别很重要。此外，为了阐明酶-底物复合物的结构，我们以1.15 Å的分辨率对普通酸催化剂Asp173被取代的D173N突变体与底物半乳糖醛酸六聚体的复合物进行了晶体结构分析。结果，证实活性中心的非还原端侧上的四个残基存在底物结合亚位点。此外，+1位点GalA残基的3位羟基没有与Asn91形成氢键，并且Asn91附近的环类似于单独的天然酶的结构。此外，以0.85 Å分辨率确定了D153N突变体复合物的晶体结构，其中Asp153（一种通用碱基催化残基候选物）被取代并且底物被确定，并与D173N复合物的结构进行比较。结果，在D153N复合物中，+1位点GalA残基3位的羟基与Asn91形成氢键，Asn91附近的环结构与天然酶和产物GalA之间的复合物结构相似塔。这证实了通用酸催化剂Asp173和糖苷氧之间的氢键对于底物的准确识别至关重要。

项目成果

Crystal structures of pyruvate phosphate dikinase from maize revealed an alternative conformation in the swiveling-domain motion.

• DOI: 10.1021/bi0484522
• 发表时间: 2005-02
• 期刊: Biochemistry
• 影响因子: 2.9
• 作者: T. Nakanishi;T. Nakatsu;M. Matsuoka;K. Sakata;H. Kato

Crystallization and preliminary crystallographic analysis of bacterial fructosyl amino acid oxidase

细菌果糖基氨基酸氧化酶的结晶及初步晶体分析

• 发表时间: 2005
• 期刊: Acta.Crystallogr F61
• 作者: Sakue;R.;Nakatsu;T.;Yamaguchi;Y.;Kato;H.;and Kajiyama;N.
• 通讯作者: N.

Expression, purification and crystallization of endopolygalacturonase from a pathogenic fungus, Stereum purpureum, in Eseherichia coli

病原真菌紫紫菌内切多聚半乳糖醛酸酶在大肠杆菌中的表达、纯化和结晶

• 发表时间: 2005
• 期刊: Protein Expression and Purification 44・2
• 作者: Haruyo Sambe;Jun Haginaka;Haruyo Sambe;Tazuko Ogawa;Masanori Nakamura;Jun Haginaka;Haruyo Sambe;Ken Hosoya;Jun Haginaka;近藤科江;近藤科江;Shinse Kondou;Hideo Saji;佐治英郎;Shinae Kondou;Kawasaki Akio;Akioka Makoto;Tetsuya Shimizu
• 通讯作者: Tetsuya Shimizu

Overexpression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of a proline-specific aminopeptidase from Aneurinibacillus sp. strain AM-1.

• DOI: 10.1107/s1744309106047543
• 发表时间: 2006-12
• 期刊: Acta crystallographica. Section F, Structural biology and crystallization communications
• 作者: M. Akioka;H. Nakano;Aya Horikiri;Y. Tsujimoto;H. Matsui;Tetsuya Shimizu;T. Nakatsu;H. Kato;Kunihiko Watanabe