ゲンジボタル・ルシフェラーゼの発光反応中間状態構造の高分解能X線結晶構造解析

源氏萤荧光素酶发光反应中间态结构的高分辨率X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
14780483
负责人：
中津亨
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University (2003)The Institute of Physical and Chemical Research (2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ホタルのルシフェラーゼによる発光反応は発光基質であるルシフェリンがMgATPにより活性化され、Luciferyl AMP中間体を酵素中でいったん形成する。そこへ酸素が攻撃することにより、AMPが放出され、生成したオキシルシフェリンが励起状態から基底状態に移るときに発光が生じると考えられている。この発光反応のメカニズムを明らかにするときに鍵となるのは、いかにしてLueiferyl AMP中間体が生成され、どのような状態で存在しているかということである。しかしその中間状態をX線結晶構造解析により直接捕まえることは困難であった。そこで中間状態を明らかにするため、中間体のルシフェリン部分をデヒドロルシフェリン、リン酸基をスルファモイル基に変換したDehydroluciferyl Sulfamoyl Adenosine (DLSA)中間体アナログを合成した。そしてこの中間体アナログがルシフェラーゼ中でどのような構造をしているのかを明らかにするため、ルシフェラーゼ:DLSA複合体のX線結晶構造解析を行った。ルシフェラーゼとあらかじめインキュベートし、結晶化を行ったところ、PEG4000を沈殿剤として用いたときに良好な結晶が得られた。大型放射光施設SPring-8のビームラインBL45PXにおいてX線回折実験を行ったところ1.3Å分解能の回折強度データが得られ、精密化を行った結果、DLSAを示す非常にきれいな電子密度が得られた。その立体構造から中間体構造の安定化に寄与している残基としては近傍に存在するHisおよびThr残基が示唆された。また赤色発光を行う変異型酵素に関しても同様の立体構造決定を行い、野生型酵素との立体構造比較を行った。その結果、ルシフェリン付近のベータシート構造の位置が動いていることが判明し、この構造の違いが発光色の違いを反映している可能性が示唆された。

在萤火虫荧光素酶的发光反应中，发光底物荧光素被MgATP激活，并在酶中形成Luciferyl AMP中间体。据认为，AMP是通过氧攻击而释放的，并且当产生的氧化荧光素从激发态转变为基态时发生发光。阐明这种发光反应机理的关键是 Lueiferyl AMP 中间体是如何产生的以及它以什么状态存在。然而，通过X射线晶体结构分析直接捕获这种中间态一直很困难。因此，为了澄清中间体状态，我们合成了脱氢荧光素氨磺酰腺苷（DLSA）的中间体类似物，其中中间体的荧光素部分转化为脱氢荧光素，磷酸基团转化为氨磺酰基。为了阐明荧光素酶中这种中间类似物的结构，我们对荧光素酶：DLSA 复合物进行了 X 射线晶体结构分析。当与荧光素酶预孵育并进行结晶时，以PEG4000作为沉淀剂得到了良好的晶体。当我们在大型同步辐射装置SPring-8的束线BL45PX进行X射线衍射实验时，我们获得了分辨率为1.3 Å的衍射强度数据，经过细化，我们获得了非常干净的电子密度，表明DLSA .三维结构表明附近的 His 和 Thr 残基有助于中间结构的稳定。我们还确定了发出红光的突变酶的三维结构，并将其与野生型酶进行了比较。结果发现，荧光素附近的β折叠结构的位置发生了移动，表明这种结构的差异可能反映了发光颜色的差异。