レトロウイルス性グリオーマモデルにおける遺伝子サイレンシングの効果

基因沉默对逆转录病毒胶质瘤模型的影响

基本信息

批准号：
17658134
负责人：
落合謙爾
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

研究代表者は「トリのグリオーマ」がA型トリ白血病ウイルス感染症であることを明らかにした。本研究課題ではトリのグリオーマ誘発ウイルス(FGV)を感染させた鶏でのRNA干渉(RNAi)の有効性を検討するためにこれまでin vitroでの効果を検討した。まず,分離されたFGVおよびFGV変異株の分子系統解析に基づき,これら分離株のenv遺伝子内に見出された共通な塩基配列を有する領域3カ所を標的とするsiRNAを作製した。今年度は昨年度までの成績を踏まえ鶏胎子線維芽細胞由来株化細胞DF-1を用いたより単純な実験系で,FGV感染または非感染DF-1に対し新たに4種類のsiRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクション効率を上げる条件およびin vitroでの遺伝子抑制効果を検討したが,いずれの条件でも充分な効果は得られなかった。一方,siRNA発現レトロウイルスベクターを用いた実験系を確立するために,遺伝子抑制作用が可視化できる蛍光タンパク質EGFP発現プラスミドを作製し,このプラスミドをDF-1細胞にトランスフェクションして恒常的にEGFPを発現する細胞の確立を検討した。レトロウイルスベクターについてはベクターの遺伝子にsiRNA発現領域を組み込む遺伝子カセットを準備した。本検索により,鶏の細胞でRNAiの有効性を検討することは現状ではきわめて難しいことがわかった。この理由として鶏では培養細胞の種類が少なく電気穿孔法や試薬導入法に使用可能な適切な細胞株が存在しないこと,主に哺乳類細胞用に調整されているトランスフェクション試薬の多くは鶏の細胞では有効ではないことがあげられる。

首席研究员透露，“禽神经胶质瘤”是一种A型禽白血病病毒感染。在这个研究项目中，我们研究了 RNA 干扰 (RNAi) 在体外感染禽神经胶质瘤诱导病毒 (FGV) 的鸡中的有效性。首先，基于对分离的 FGV 和 FGV 突变株的分子系统发育分析，我们创建了针对这些分离株的 env 基因中具有共同碱基序列的三个区域的 siRNA。今年，基于去年的结果，我们将使用更简单的实验系统，使用鸡胎儿成纤维细胞来源的细胞系DF-1，并且我们将使用四种新的siRNA转染试剂用于FGV感染或未感染的DF- 1.我们研究了提高转染效率的条件和体外基因抑制的效果，但在任何条件下都没有获得足够的效果。另一方面，为了建立使用表达siRNA的逆转录病毒载体的实验系统，我们创建了表达荧光蛋白EGFP的质粒，该质粒可以使基因抑制效果可视化，并将该质粒转染到DF-1细胞中以组成型产生我们研究了表达细胞的建立。对于逆转录病毒载体，我们制备了将siRNA表达区整合到载体基因中的基因盒。这项研究表明，目前检查 RNAi 在鸡细胞中的有效性极其困难。其原因是鸡体内培养的细胞种类较少，没有合适的细胞系可以用于电穿孔或试剂引入方法，这意味着它并不有效。