遺伝子にコードされた蛋白質を用いた細胞内シグナル伝達の光制御技術の開発

利用基因编码蛋白开发细胞内信号转导光控技术

基本信息

批准号：
17655073
负责人：
築地真也
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17655073/
关键词：
ケージド蛋白質 Phytochrome B PIF3

项目摘要

細胞内シグナル伝達を「光」を用いて、望みのタイミングや望みの場所で活性化あるいは不活性化するための技術は、細胞生物学や細胞工学における強力な研究ツールとなりうる。特に、キナーゼ群によるリン酸化カスケードは多彩な細胞機能の中枢を担っており、細胞内キナーゼの活性状態を光で人為的にオン-オフ制御するための方法論の確立は極めて重要であると考えられる。そのための化学的アプローチとして、光分解性保護基を利用したケージド蛋白質が使用されてきた。しかし、そのケージド蛋白質の合成は決して容易ではなく、またそれを細胞内で応用するためには、マイクロインジェクションなどの熟練した技術が必要になる。そこで本研究では、遺伝子にコードされた蛋白質を用いて、生細胞内キナーゼの活性を時空間的に光制御するための基礎技術の開発を試みる。具体的には、植物シロイヌナズナ由来の光受容蛋白質PhyBおよびその相互作用パートナーPIF3の赤色光依存的な二量体形成を基本原理として利用する。そこで本年度はまず、1)PhyBとPIF3が動物細胞内で発現されるか?、そして2)赤色光によって二量体を形成するか?の二点について確認を行うことを目標に実験を進めた。PhyBおよびPIF3のさまざまな改変体および緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合体の発現プラスミドを作成し、いくつかの細胞株を用いて遺伝子発現を行った。GFP由来の蛍光観察やウエスタンブロッティングなどの実験の結果、これまでに、PIF3の発現は確認できているが、PhyBの発現が全く確認できていない。もともとこれらの蛋白質は植物由来であるため、転写後のスプライシング、コドンの使用頻度、発現後の細胞内安定性の問題などが考えられる。そこで、今後はこれらの可能性について一つずつ検証を進めて行く予定である。

利用光在所需时间和地点激活或灭活细胞内信号转导的技术可以成为细胞生物学和细胞工程中强大的研究工具。特别是，激酶的磷酸化级联在多种细胞功能中发挥着核心作用，建立利用光人为控制细胞内激酶开关状态的方法被认为极其重要。作为用于此目的的化学方法，已经使用了使用可光降解保护基团的笼状蛋白。然而，笼状蛋白的合成绝非易事，为了将其应用到细胞内，需要显微注射等熟练技术。因此，在这项研究中，我们将尝试开发一种利用基因编码蛋白时空光控活细胞中激酶活性的基本技术。具体来说，我们以源自植物拟南芥的光感受器蛋白PhyB及其相互作用伙伴PIF3的红光依赖性二聚体形成作为基本原理。因此，今年我们进行了实验，目的是确认两点：1）PhyB和PIF3在动物细胞中是否表达？2）它们在红光照射下是否会形成二聚体？我们为 PhyB 和 PIF3 的各种变体创建了表达质粒，并与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合，并使用多种细胞系进行基因表达。 GFP来源的荧光观察和Western blotting等实验的结果，确认了PIF3的表达，但根本没有确认PhyB的表达。由于这些蛋白最初来源于植物，因此表达后可能存在转录后剪接、密码子使用频率和细胞内稳定性等问题。因此，我们计划未来对这些可能性进行一一验证。