禽致病性大肠杆菌ompT质粒编码基因的特殊致病作用及其成因研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号:
    31672553
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    62.0万
  • 负责人:
  • 依托单位:
  • 学科分类:
    C1803.兽医细菌及其他微生物学
  • 结题年份:
    2020
  • 批准年份:
    2016
  • 项目状态:
    已结题
  • 起止时间:
    2017-01-01 至2020-12-31

项目摘要

Outer membrane protein T (OmpT) encoded by the ompT gene located on plasmid ColⅤ of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strain E058 was found unable to inactivate the protamine which is the main substrate of the outer membrane protease encoded by chromosomal ompT gene of E. coli. When half of the OmpT encoding gene of ColⅤ plasmid origin (pompT) was knocked out from the APEC strain E058, the virulence of the mutant E058Δ50% pompT declined at 10-fold level evaluated by 50% lethal dose determination assay compared to the wild-type strain E058. Meanwhile, whole pompT gene was knocked out from the strain E058, the virulence of the mutant E058 Δ100% pompT was as equal as that of the wild-type strain. To explore the mechanism of OmpT encoded by pompT (pOmpT) lost its activity of protamine inactivation, the crystal structure analysis of pOmpT will be performed using the expressing pOmpT, and the promoter of pompT was replaced by that of the chromosomal ompT gene, to see whether the activity of protamine inactivation was obtained by the reconstructed pOmpT or not. RNA sequencing was employed to discover the both up-regulated expression genes and down-regulated genes and the potential regulation network of virulence genes governed by pompT under both in vivo and in vitro conditions. For in vivo, E058 Δ50% pompT and E058 Δ100% pompT were inoculated into 1-day-old specific pathogen free (SPF) chickens, respectively. Bacteria were collected from the blood of infected birds at 3 hours post-challenge, and total RNA from these bacteria was extracted and purified. For in vitro, total RNA was extracted and purified from bacteria grown in Luria-Bertani medium, then the total RNAs mentioned above were subjected to RNA sequencing. E058 Δ50% pompT was significantly attenuated based on the 50% lethal dose determination in 1-day-old SPF chickens, and the results of the colonization and persistence assay carried out in 35-day-old SPF birds. 25%, 15% and 5% fragments among 50% pompT mentioned above were selected and knocked out from the ColⅤ plasmid of strain E058, and E058Δ25%pompT、E058Δ15%pompT and E058Δ5%pompT mutants were generated, and 50% lethal dose determination and the colonization and persistence assay were also performed for these mutants. The mutant with both the attenuated virulence and the shortest knockout gene fragment, together with its revertant strain will be evaluated both in 50% lethal dose determination and the colonization and persistence assay to confirm the virulence complementation for the revertant strain. RNA sequencing will also be employed for the mutant with the shortest knockout gene mentioned above which grown in vivo and in vitro, to confirm the RNA sequencing results derived from E058Δ50%pompT. This study is some of help to develop the antimicrobial drug related to the inactivation of OmpT, to explore the pathogenesis of pompT and to provide a new target for both the pathogenesis study and the immunology study of avian colibacillosis.
禽致病性大肠杆菌(APEC)E058株质粒编码的外膜蛋白OmpT(pOmpT)不能灭活抗菌肽,但其染色体编码的OmpT能灭活抗菌肽;敲除50% OmpT质粒编码基因(pompT)的突变株(E058 Δ50% pompT)毒力下降10倍,而敲除100%该基因的突变株毒力不变。通过蛋白晶体结构分析和启动子替代试验,剖析pOmpT不能灭活抗菌肽的结构与分子机制;通过E058 Δ50% pompT突变株体内、体外转录组测序分析,揭示pompT主导的APEC毒力调控机制;对50% pompT基因片段进行截短突变,获得显著影响E058株毒力的更短pompT基因片段突变株,通过进一步的转录组学分析,精炼pompT主导的APEC毒力调控机制。本研究有助于厘清APEC pompT基因与其特殊致病作用的关系,为APEC致病、免疫机理的研究提供新靶标。

结项摘要

禽致病性大肠杆菌E058株质粒编码的外膜蛋白OmpT(pOmpT)不能灭活鱼精蛋白,但其染色体编码的OmpT(cOmpT)能灭活鱼精蛋白。本研究表达出无自水解活性的点突变蛋白pOmpT K217G (赖氨酸(K)→甘氨酸(G)),通过优化结晶条件,最终获得可以正常衍射的蛋白晶体,发现pOmpT与已发表的cOmpT结构存在明显差异。通过融合PCR,实现cOmpT、pOmpT 5个环的互换和第5环中差异氨基酸位点的单互换和双互换,并在重组菌中表达嵌合蛋白进行鱼精蛋白裂解试验。发现cOmpT的第5环是决定鱼精蛋白裂解能力的关键环,经过多重试验证实,cOmpT与pOmpT灭活鱼精蛋白能力差异的原因在于cOmpT的267位天冬氨酸(D)和276位丝氨酸(S)为丝氨酸蛋白酶活性位点,而pOmpT的267位丝氨酸(S)和276位苏氨酸(T)非丝氨酸蛋白酶活性位点,导致其不能裂解鱼精蛋白。对50% pompT、100% pompT突变株进行转录组测序,发现50% pompT突变株中受影响的差异基因较多,涉及摄铁系统/铁离子载体、生物被膜形成等可能影响细菌毒力的相关基因。构建pompT系列截短突变株,LD50测定和体内定居试验结果显示,25%pompT为影响上述致病性的最短pompT基因片段。25%pompT突变株体内、外转录组测序结果表明,与亲本株E058相比,25% pompT突变株中受影响的差异基因数量比50% pompT突变株更多,但仍主要涉及摄铁系统/铁离子载体、生物被膜形成等可能影响毒力的相关基因。本研究主要发现了pOmpT与cOmpT结构存在显著差异;同时,发现cOmpT的267位天冬氨酸(D)和276位丝氨酸(S)为丝氨酸蛋白酶活性位点;明确了25%pompT为影响APEC E058株致病性的最短pompT基因片段,从而为深化禽大肠杆菌病致病机理、防控提供了新视角。

项目成果

期刊论文数量(8)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定
  • DOI:
    10.11843/j.issn.0366-6964.2020.12.021
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
    畜牧兽医学报
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    薛菲;杨梓纯;许炎辉;王娅玲;喻婷;樊毛迪;刘娟华;高崧;刘秀梵
  • 通讯作者:
    刘秀梵
SodA Contributes to the Virulence of Avian Pathogenic Escherichia coli O2 Strain E058 in Experimentally Infected Chickens
SodA 有助于增强实验感染鸡中禽致病性大肠杆菌 O2 菌株 E058 的毒力
  • DOI:
    10.1128/jb.00625-18
  • 发表时间:
    2019-03-01
  • 期刊:
    JOURNAL OF BACTERIOLOGY
  • 影响因子:
    3.2
  • 作者:
    Gao, Qingqing;Xia, Le;Gao, Song
  • 通讯作者:
    Gao, Song
Unexpected transcriptome pompTʹ contributes to the increased pathogenicity of a pompT mutant of avian pathogenic Escherichia coli
意外的转录组 pompTÊ1 导致禽致病性大肠杆菌 pompT 突变体的致病性增加
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2018
  • 期刊:
    Veterinary Microbiology
  • 影响因子:
    3.3
  • 作者:
    Juanhua Liu;Xiaohui Mu;Xiaobo Wang;Haixia Huan;Qingqing Gao;Juan Chen;Peizhuang Qiao;Luyao Jiang;Song Gao;Xiufan Liu
  • 通讯作者:
    Xiufan Liu
Virulence traits and pathogenicity of uropathogenic Escherichia coli isolates with common and uncommon O serotypes
常见和罕见O血清型泌尿道致病性大肠埃希菌的毒力特征和致病性
  • DOI:
    10.1016/j.micpath.2017.01.027
  • 发表时间:
    2017-03-01
  • 期刊:
    MICROBIAL PATHOGENESIS
  • 影响因子:
    3.8
  • 作者:
    Gao, Qingqing;Zhang, Debao;Liu, Xiufan
  • 通讯作者:
    Liu, Xiufan
Transcriptional analysis of RstA/RstB in avian pathogenic Escherichia coli identifies its role in the regulation of hdeD-mediated virulence and survival in chicken macrophages
禽致病性大肠杆菌中 RstA/RstB 的转录分析确定了其在调节 hdeD 介导的鸡巨噬细胞毒力和存活中的作用
  • DOI:
    10.1016/j.vetmic.2019.108555
  • 发表时间:
    2020-02-01
  • 期刊:
    VETERINARY MICROBIOLOGY
  • 影响因子:
    3.3
  • 作者:
    Gao, Qingqing;Su, Senyan;Gao, Song
  • 通讯作者:
    Gao, Song

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其他文献

江苏省部分地区淡水产品中弧菌菌群及其致病性分析
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2013
  • 期刊:
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  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    杨振泉;唐伟;高崧;方维明
  • 通讯作者:
    方维明
应用DNA芯片技术研究体外表达禽致病性大肠杆菌可能致病基因
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    --
  • 期刊:
    微生物学报
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    --
  • 作者:
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    高崧
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    --
  • 发表时间:
    2013
  • 期刊:
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  • 影响因子:
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  • 作者:
    杨振泉;杭莉;高崧;方维明
  • 通讯作者:
    方维明
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  • 发表时间:
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  • 期刊:
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  • 影响因子:
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  • 作者:
    韦东杰;高崧;申自勇;陈清*
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姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合对CCl4诱导的建鲤肝损伤的保护作用
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  • 发表时间:
    2018
  • 期刊:
    江苏农业学报
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    曹丽萍;杜金梁;贾睿;殷国俊;Galina Jeney;丁炜东;高崧
  • 通讯作者:
    高崧

其他文献

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高崧的其他基金

靶向APEC OmpT裂解作用的CATH-3分子改造与杀菌机制研究
  • 批准号:
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AI项目解读示例

课题项目:调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要:

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题,其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子,其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而,TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用,影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法,探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用,为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义,并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路:

科学问题:TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达?
前期研究:已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应,但其具体机制尚不明确。
研究创新点:本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线:包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术:TRIM2与病毒RNA的相互作用分析,IFN-β启动子活性检测。
实验模型:使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
      
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