環境微生物の機能遺伝子の視覚的検出

环境微生物功能基因的视觉检测

基本信息

批准号：
17651044
负责人：
大橋晶良
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

微生物を培養によらずシングルセルかつ特異的に検出可能な技術の1つにFluorescence in situ hybridization(FISH)法がある。rRNAを標的としたFISH法はかなり熟成の域に入ってきたものの、mRNAや遺伝子を標的とした場合、蛍光標識プローブを用いたFISH法では感度が不十分である。そこでより高感度検出が可能な手法としてtyramide signal amplification(TSA)によりシグナル増幅を行うTSA-FISH法がある。しかしながらTSA-FISH法を適用するためには反応を触媒する酵素を菌体内に浸透させる必要がある。しかしながら酵素は非常に大きく、通常の固定だけでは菌体内への浸透は困難であるため、適切な細胞壁処理技術が必要である。またmRNAや遺伝子はTSA-FISH法を用いたとしても十分な感度が得られず、信頼のおける検出は困難である。そこでより高感度な検出技術の開発も試みた。細胞壁処理技術についてはこれまでに知見の得られていないメタン生成古細菌に着目し、検討を行った。その結果シュードムレイン加水分解酵素PeiWを細胞壁処理技術の1つとして提案できる結果が得られた。しかしながらこの処理技術ではメタン生成古細菌を網羅的に検出できないため、更なる検討が必要である。また高感度化としてtwo-pass TSA-FISH法を原核生物に適用するための最適化を行った。その結果TSA-FISH法では検出できなかったmRNAを、本技術を用いることで検出に成功した。本研究から得られた知見は、微生物の機能を培養によらず推定するための重要な技術基盤になると考えられる。今後はより多くの微生物種にTSA-FISH法を適用するための処理技術の開発とともに、微生物染色体に保存されている遺伝子を検出するためのtwo-pass TSA-FISH法の最適化が課題である。

可以是单个细胞并通过培养特异性检测微生物的技术之一是原位杂交（FISH）。尽管rRNA靶向的鱼方法已进入相当大的衰老，但如果靶向mRNA或基因，则使用荧光标签的鱼方法不足。因此，有一种TSA-FISH方法可以通过Tyramide信号扩增（TSA）作为信号放大，可以实现更高敏感性检测。但是，为了采用TSA-FISH方法，有必要穿透将反应催化为细菌的酶。但是，该酶很大，仅用正常固定就可以渗透在细菌中，因此需要适当的细胞壁处理技术。同样，即使使用了TSA-FISH方法，mRNA和基因也没有足够的敏感性，并且很难可靠的检测。因此，我们试图开发更敏感的检测技术。我们专注于细胞壁加工技术，专注于迄今为止尚未获得的甲烷生成细菌。结果，提出将Schodmrain水解酶PEIW作为细胞壁处理技术之一的结果。但是，对于甲烷生产的细菌，无法全面检测到这种加工技术，因此需要进一步考虑。此外，我们优化了将两次通用TSA-FISH方法应用于原始生物学的较高灵敏度。结果，通过使用该技术成功检测到无法通过TSA-FISH方法检测到的mRNA。从这项研究中获得的知识被认为是估计微生物功能的重要技术基础设施，而不论文化如何。将来，随着加工技术用于将TSA-FISH方法应用于更多的微生物物种，两次通用TSA-Fish方法的优化是检测在微生物染色体中存储的基因的问题。