微生物機能遺伝子の発現を視覚化する-FISH法の超高感度化と細胞処理技術の開発-

微生物功能基因表达可视化 - 超高灵敏度FISH方法和细胞处理技术的开发 -

基本信息

批准号：
19656133
负责人：
大橋晶良
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、微生物に高感度two-pass TSA-FISH法を適用するため、次のような開発と検討を行った。1)mRNA及び遺伝子を検出するための高感度two-pass TSA-FISH⇒の開発存在数の少ない標的を検出するために、シグナル増幅法であるTSA法を二度繰り返すtwo-pass TSA-FISH法の開発を行い、mRNAの可視化に成功した。しかし、スライド上において菌体以外からの非特異高なバックグラウンドが増大するという問題に直面した。これは従来のFISH法では問題にならず、高感度な本手法の特有の問題であると思われる。そこで、全ての反応をチューブ内で行うように方法を変更したところ、非特異的なバックグラウンドの抑制に成功した。これにより若干の計画変更が生じたが、開発することができた。2)高分子なHRP酵素を細⊃内に浸透させるための細⊃壁処理方⇒の険討嫌気発酵リアクター汚泥内のメタン生成古細菌に対し、高感度FISH法を適用するための検討を行った。その結果、メタン生成古細菌は多様な細胞壁構造を有しており、個別の酵素処理を必要とすることがわかった。しかし、シュードムレイン自己分解酵素を用いることで、すべての細胞壁にある程度の処理効果があることがわかり、汎用性の高い処理方法の知見を得ることができた。3)高交雑効率をOする人工核酸プローブの原核生物への適N高交雑効率を有する人工核酸プローブが本手法に適用可能か検討したところ、標的の存在数が低くてもプローブが標的に十分に結合できることがわかった。また、人工核酸塩基の挿入位置やミスマッチに対する影響について検討し、環境サンプルについても適用可能であった。

在本研究中，我们开发并研究了以下内容，以便将高灵敏度的二次 TSA-FISH 方法应用于微生物。 1) 开发用于检测 mRNA 和基因的高灵敏度双通道 TSA-FISH ⇒ 重复信号放大方法 TSA 两次以检测低丰度目标的双通道 TSA-FISH 方法我们开发了该方法，并成功实现了 mRNA 可视化。然而，我们遇到了载玻片上细菌细胞以外来源的非特异性背景增加的问题。这不是传统 FISH 方法的问题，但似乎是这种高灵敏度方法特有的问题。因此，他们改变了方法，使所有反应都在试管中进行，并成功抑制了非特异性背景。尽管这导致计划发生一些变化，但我们还是能够开发它。 2) 研究处理薄壁以使高分子 HRP 酶渗透到细胞中的方法我们研究了高灵敏度 FISH 方法对厌氧发酵反应器污泥中产甲烷古菌的应用。结果表明，产甲烷古菌具有不同的细胞壁结构，需要单独的酶处理。然而，通过使用假毛蕊花自溶酶，我们发现所有细胞壁都具有一定程度的处理效果，并且我们能够获得高度通用的处理方法的知识。 3) 高杂交效率的人工核酸探针对原核生物的适用性当我们研究高杂交效率的人工核酸探针是否可以应用于该方法时，我们发现即使靶标的数量较多，探针也足以靶向靶标。事实证明它可以与结合起来。此外，我们还研究了人工核碱基的插入位置及其对错配的影响，结果适用于环境样品。