骨再生を目指した転写因子Osterixの機能調節機構の解明

阐明转录因子Osterix对骨再生的功能调节机制

• 批准号: 16659567
• 负责人: 加我 正行
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659567/
• 关键词: オステリックス; 転写因子; 骨芽細胞様細胞

昨年度に引き続き、Osterix転写活性化領域の詳細を同定するために、GAL4-binding sitesと連接させたルシフェラーゼreporter plasmidを用いたGal4融合システムレポーター分析を行い、Osterixの転写活性を調べた。その結果、Osterixの転写活性領域がプロリンとグリシン残基に富んでおり、哺乳類とイーストの細胞における活性の特性を持っていることを認めた。GST-pull down分析および免疫沈降法では、TBPではなく、基本転写因子であるTF-IIBが転写活性領域に結合することを示した。さらに、Osterix相互作用因子を探索するために、FLAG-tagを付加したOsterix発現plasmidを培養細胞に導入し、αFLAG抗体を用いた免疫沈降法を行ったところ、in vivoとin vitroにおいて、OsterixがそのC末端Zinc-Finger領域を通して、クロマチンリモデリング因子Brg-1および癌抑制遺伝子p53と相互作用することを見つけた。Osterixにより発現制御される遺伝子群の検索するために、G418耐性遺伝子を有したOsterix発現plasmidを作製し、薬剤選択によりOsterix遺伝子をstableに過剰発現するSaOS2細胞を樹立し、その遺伝子発現について解析した。RT-PCR法により骨芽細胞特異的遺伝子群の発現について検討したところ、Osterix導入により、親株のSaOS2細胞に比べてオステオカルシンmRNAの亢進が確認できたが、アルカリ性ホスファターゼmRNAの発現には影響がみられなかった。さらに、網羅的遺伝子発現解析を行った結果、Osterix導入により発現亢進また抑制される遺伝子が多数検出された。

继去年之后，为了确定Osterix转录激活区域的细节，我们使用与GAL4结合位点连接的荧光素酶报告质粒进行了Gal4融合系统报告基因分析，以检查Osterix的转录活性。结果，他们发现Osterix的转录活性区域富含脯氨酸和甘氨酸残基，这是其在哺乳动物和酵母细胞中的活性特征。 GST-pull down 分析和免疫沉淀表明基本转录因子 TF-IIB（而非 TBP）与转录活性区域结合。此外，为了寻找 Osterix 相互作用因子，我们将带有 FLAG 标签的 Osterix 表达质粒引入培养细胞中，并使用 αFLAG 抗体进行免疫沉淀，我们发现它与染色质重塑因子 Brg-1 和肿瘤抑制因子相互作用。基因 p53 通过其 C 末端锌指区域。为了寻找Osterix表达调控的基因，我们构建了含有G418抗性基因的Osterix表达质粒，通过药物选择建立了稳定过表达Osterix基因的SaOS2细胞，并分析了基因表达。当使用 RT-PCR 检查成骨细胞特异性基因的表达时，证实与亲代细胞系 SaOS2 细胞相比，Osterix 的引入增强了骨钙素 mRNA，但对碱性磷酸酶 mRNA 的表达没有影响。 t。此外，综合基因表达分析的结果，检测到许多基因的表达因Osterix的引入而增加或抑制。