ヒト側頭骨病理標本からレーザーキャプチャー・ダイセクションによる難聴遺伝子の抽出

激光捕获解剖从人颞骨病理标本中提取听力损失基因

基本信息

批准号：
16659462
负责人：
喜多村健
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

難聴の病態を解析するために、難聴発症の原因が明瞭である難聴遺伝子変異の定量解析と内耳組織病理の相関を検討した。本年度に対象とした症例は、非症候群性遺伝性難聴であるミトコンドリアDNA7511変異である。対象症例のセロイジン包埋側頭骨標本の切片上でレーザーを用いて、蝸牛有毛細胞、血管条、ラセン神経節細胞を数個ずつ採取した。採取した細胞からpure gene kitにてDNAを抽出しTaqMan PCRにて定量的PCRを施行した。当該遺伝子変異は、TaqMan PCRにて増幅可能なプライナー設計が不能と判明した。ミトコンドリアDNA3243変異であるMELAS症例の側頭骨病理においては、遺伝子変異の定量解析と病理変化の相関を既に報告している(Laryngoscope,2003)。本年度は、同じミトコンドリアDNA3243変異であるMELAS症例の側頭骨病理を新たに採取・DNAを抽出し、定量的PCRを施行して、遺伝子変異量と病理変化の相関を解析中である。ヒト側頭骨を、病理解剖時に採取・凍結保存し、RNA later溶液中にて骨迷路を削り、蝸牛・前庭の膜迷路を採取して、RNAを抽出した。TaqMan probeを用いたりアルタイムPCR法により、COCH、SLC26A4、CDH23、ATP2B2のmRNAの定量を行った。ヒト側頭骨を前期高齢者(65歳以上75歳未満)と超高齢者(90歳以上)の2群に分類して、両者間のmRNAの差を解析中である。

为了分析听力损失的病理学，我们研究了听力损失基因突变的定量分析与内耳组织病理学之间的相关性，其中听力损失基因突变具有明确的听力损失发病原因。今年的目标病例是线粒体DNA 7511突变，这是一种非综合征性遗传性听力损失。使用激光在目标病例的嵌有赛璐珞的颞骨标本的切片上收集了一些耳蜗毛细胞、血管纹和螺旋神经节细胞。使用纯基因试剂盒从收集的细胞中提取DNA，并使用TaqMan PCR进行定量PCR。结果发现，基因突变使得设计可通过 TaqMan PCR 扩增的衬管变得不可能。关于线粒体DNA3243突变的MELAS病例的颞骨病理，我们已经报道了基因突变与病理变化之间的定量分析（Laryngoscopy，2003）。今年，我们目前正在采集具有相同线粒体DNA 3243突变的MELAS患者新的颞骨病理样本，提取DNA，进行定量PCR，分析基因突变量与病理变化的相关性。病理尸检时采集人颞骨并冷冻保存，在RNA后期溶液中刮取骨迷路，采集耳蜗和前庭的膜迷路提取RNA。使用TaqMan探针或实时PCR方法对COCH、SLC26A4、CDH23和ATP2B2的mRNA进行定量。我们将人类颞骨分为两组：早期老年人（65 岁至 75 岁以下）和高龄老年人（90 岁及以上），目前正在分析两组之间 mRNA 的差异。