薬剤標的分子同定のための分裂酵母ケミカルゲノミクス

用于药物靶分子鉴定的裂变酵母化学基因组学

基本信息

批准号：
16658039
负责人：
吉田稔
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658039/
关键词：
分裂酵母ケミカルゲノミクス Gateway ポストゲノム標的分子

项目摘要

分裂酵母は細胞周期研究のモデル生物として有名であるが、ゲノム配列が決定されると、わずか4,900の遺伝子しか持たない、これまでに知られる最もゲノムサイズの小さな真核生物であることが判明した。にもかかわらず、イントロンや発現調節などは出芽酵母より高等真核生物に近く、驚くべきことに100種類以上ものヒト疾病医関連遺伝子が保存されており、ケミカルゲノミクスを行うための優れた生物である。我々のグループは、世界に先駆けてこの分裂酵母全遺伝子ORFのGateway法によるクローン化に成功した。そこで取得した4,900のORFを誘導可能なプロモーターによって分裂酵母内で発現させ、これを利用して薬剤標的分子同定のための基盤技術を確立することを目的とした。取得したORFの全てについて誘導発現が可能なnmt1プロモーターの制御下におき、C-末端にHis6-Flagという短いタグを連結した発現ベクターを作製し、分裂酵母のleu1-32遺伝子座にインテグレーションさせた形質転換株を作製した。全遺伝子の98%にあたる約4800遺伝子について形質転換株が取得された。これら全ての形質転換株について1つずつHisタグ抗体によるウェスタンブロット解析を行った結果、4300以上のクローンで発現が確認された。得られた発現クローンを用いて、標的分子がわかっている既存薬(フルコナゾール)に対する感受性が、標的分子あるいはそのパスウェイの過剰発現によって変化するかどうかを確認した。その結果、フルコナゾールの標的であるエルゴステロール合成に関与するシトクロムP-450の過剰発現株はフルコナゾール耐性となることが確認された。したがって本研究により、分裂酵母ポストゲノムを用いたケミカルゲノミクスが可能であることが示された。

裂殖酵母作为细胞周期研究的模型生物而闻名，但当对其基因组进行测序时，发现它是迄今为止已知的最小的真核生物，只有 4,900 个基因。尽管如此，其内含子和表达调控比酿酒酵母更接近高等真核生物，并且令人惊讶的是，超过 100 个与人类疾病相关的基因是保守的，这使其成为进行化学基因组学的优秀生物体。我们的团队是世界上第一个使用Gateway方法成功克隆该裂殖酵母基因的整个ORF的团队。本研究的目的是利用诱导型启动子表达裂殖酵母中获得的4,900个ORF，并利用其建立识别药物靶分子的基础技术。我们将所有获得的 ORF 置于允许诱导表达的 nmt1 启动子的控制下，创建了一个表达载体，该表达载体带有连接到 C 末端的称为 His6-Flag 的短标签，并将其整合到 leu1-32 裂变基因位点中产生了转化菌株。获得了约4,800个基因的转化菌株，占所有基因的98%。对所有这些转化菌株一一进行使用His标签抗体的蛋白质印迹分析，结果在4,300多个克隆中确认了表达。使用获得的表达克隆，我们确认了对目标分子已知的现有药物（氟康唑）的敏感性是否因目标分子或其途径的过度表达而改变。结果证实，过表达细胞色素P-450（细胞色素P-450参与氟康唑靶标麦角甾醇的合成）的菌株对氟康唑具有耐药性。因此，这项研究证明使用裂殖酵母后基因组的化学基因组学是可能的。