メタロチオネインのアミノ酸置換が引き起こす影響

金属硫蛋白中氨基酸取代引起的影响

基本信息

批准号：
15659140
负责人：
永沼章
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659140/
关键词：
カドミウムメタロチオネイン遺伝子多型ノックダウン細胞 siRNA

项目摘要

カドミウム毒性に対する防御蛋白質としてメタロチオネインが知られている。我々はメタロチオネインの遺伝子多型を検討し、転写開始地点の上流5塩基目とエクソン3領域に多型の存在を明らかにした。さらにエクソン部に塩基変異の認められた全例が転写開始地点上流にも変異有することも判明した。両多型の存在率から推定すると、この結果を偶然とは考えにくい。そうであれば、エクソン部と転写開始地点上流の両方に塩基変異のある人間は成人まで成長することができるが、エクソン3にのみ変異を有する個体は何らかの理由で生まれてこないか、生まれたとしても成人になる前に死亡してしまうという可能性が考えられる。そこで本研究は、変異型のメタロチオネインが細胞増殖に与える影響を検討することによって、エクソン3領域における塩基変異が細胞機能に与える影響を明らかにすることを目的とした。まず、マウス肝由来のメタロチオネイン次損細胞中でのこれら変異メタロチオネインの発現を検討したが、その発現量は極端に少なかった。そこで、遺伝子導入効率の良いヒト培養細胞を用いることにした。まず、siRNA法を用いてヒト由来細胞中のメタロチオネイン-II(ヒト細胞中の主要分子種)のノックダウンを試みた。様々な検討の結果、メタロチオネイン-IIの通常発現レベルが低下しているだけでなくカドミウムや亜鉛による誘導も認められないノックダウン細胞を作成することに成功した。本細胞はカドミウムに対して高に感受性を示し、ここに正常なメタロチオネイン遺伝子を導入してもこの感受性は回復しないことから、siRNAが効率良く機能してメタロチオネインmRNAの分解が生じていると考えられる。また、塩基配列を改変し(アミノ酸配列は正常)、この細胞中に導入してもsiRNAによって認識されないメタロチオネイン-II遺伝子の作成にも成功した。

金属烷被称为镉毒性的防御蛋白。我们考虑了Metalico Onane的遗传多型，并在上游五个基部和起点上的Exonson 3区域揭示了多方面的存在。此外，还发现，外显子中碱突变允许的所有病例都在转移起点的上游一个突变。如果您从两种类型的存在率中估计，则该结果不太可能是偶然的。如果是这样，一个具有基本转型的人可以在外显子部分和转移起点上游的成年人中成长，但是仅出于某种原因而出生或出生的人他们可能会在成年人之前死亡。因此，这项研究旨在通过检查突变金属烷对细胞生长的影响，阐明碱突变对外显子3区域细胞功能的影响。首先，我们检查了这些突变金属烷在小鼠衍生的金属烷衍生细胞中的表达，但表达非常低。因此，我们决定使用具有良好基因引入效率的人类培养细胞。首先，我尝试使用siRNA方法将人类衍生细胞中的金属烷-II（人类细胞中的主要分子物种）击倒。由于各种检查，我们成功地创建了敲除细胞，不仅降低了金属烷-II的正常表达水平，而且不允许镉或锌指导。该细胞对镉高度敏感，据认为siRNA功能有效并分解了Metalico Onane mRNA，因为即使在这里引入了正常的金属基因，也无法恢复。另外，基本序列已被修饰（氨基酸序列是正常的），并且成功地创建了金属烷烷-II基因，即使将其引入这些细胞，也无法识别出它。