siRNA法による全メタロチオネイン分子種発現抑制細胞の作成

使用 siRNA 方法创建抑制所有金属硫蛋白分子种类表达的细胞

• 批准号: 16659034
• 负责人: 永沼 章
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659034/
• 关键词: メタロチオネイン; siRNA; 遺伝子ノックダウン; 分子種特異的発現; カドミウム; ヒト由来細胞; メタロチオネイン; siRNA; 遺伝子ノックダウン; 分子種特異的発現; カドミウム; ヒト由来細胞

ヒト体内に蓄積したカドミウムの大部分は生体防御蛋白質メタロチオネインと結合することによってその毒性発現が抑えられている。ヒトのメタロチオネインには10種以上の構造的に類似する分子種が存在するが、このように多くの分子種が存在する意義は全く分かっていない。この疑問を解くためには、全てのメタロチオネイン分子種を欠損したヒト由来細胞が研究材料として必須である。そこで、本研究では全てのメタロチオネイン分子種の発現が抑制されたヒト培養細胞をsiRNA法を用いて樹立すると共に、本細胞に、siRNAによって認識されないように工夫を凝らしたメタロチオネイン分子種の遺伝子を一つずつ発現させて、それぞれの分子種の機能の比較を可能とすることを目指した。全メタロチオネイン分子種に共通して存在する複数の塩基配列部分をそれぞれ含む種々のsiRNA発現プラスミドを構築し、それらを個々にヒト由来培養細胞に導入し、リアルタイムPCR法によって全メタロチオネイン分子種の発現程度をそれぞれ調べることによって、最も効率良く全てのメタロチオネイン分子種の発現を抑制するsiRNAを選択した。このsiRNA発現プラスミドを用いることによって、恒常的にsiRNAを発現する細胞株を得ることに成功した。この細胞が保持するメタロチオネイン分子種の発現は全て、有意に減少していることが確認され、また、本細胞はカドミウムに対して高い感受性を示した。この細胞中にメタロチオネインIまたはIIを単独で発現させることにも成功し、メタロチオネイン各分子種の作用検討に利用可能な細胞株を樹立することができた。

通过与生物防御蛋白金属硫蛋白结合来抑制人体中积累的大多数镉。人类金属硫蛋白的结构上有十种以上的结构相似的分子物种，但是这么多分子物种的存在的意义尚不清楚。为了回答这个问题，在所有金属硫蛋白分子物种中缺乏的人类衍生细胞作为研究材料必不可少。因此，在这项研究中，我们建立了人类培养的细胞，其中使用siRNA方法抑制了所有金属硫硫代硫蛋白分子物种的表达，并旨在表达金属硫硫代硫蛋白分子物种在该细胞中旨在防止它们被siRNA识别的基因，从而可以比较每种分子物种的功能。构建了所有金属硫硫代硫代蛋白分子物质共有的多个基础序列部分的各种siRNA表达质粒，并通过检查所有金属硫硫代分子PCR的表达程度，并通过抑制所有金属硫硫代分子的表达，并通过检查所有金属蛋白分子物种的表达程度，并通过检查所有金属硫硫代分子物种的表达程度。通过使用该siRNA表达质粒，我们成功地获得了一种组成型siRNA的细胞系。据证实，该细胞保留的金属硫蛋白分子物质的所有表达均显着降低，并且细胞非常容易受到镉的影响。金属硫蛋白I或II在这些细胞中也成功表达，可用于研究各种类型的金属硫蛋白的作用的细胞系。