臍帯血由来間葉系幹細胞を用いた硝子軟骨形成の誘導

使用脐带血间充质干细胞诱导透明软骨形成

• 批准号: 13877242
• 负责人: 内尾 祐司
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Shimane Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877242/
• 关键词: 臍帯血; 間葉系幹細胞; 軟骨細胞

母体に合併症のない症例より分娩時に両親の書類上の同意を得た後、臍帯血、胎盤血をヘパリン加採血した。検体は採取後24時間以内に処理を行った。前年度同様にPercoll(1.080g/ml)を用いた比重遠心法で単核球を分離した。分離した単核球をtype I collagen coatedプラスティックディッシュに播種(1×10^6cells/cm^2)し20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いて培養を行った。また、採取し分離した単核球の一部に対してフローサイトメトリーを用い表面抗原の発現を調べた。検索した表面抗原はCD14,29,34,44,68,105である。培養により接着性細胞の存在と、コロニーの形成が観察された。接着性の細胞が出現した時点でbFGF(5ng/ml)を添加し細胞の増殖を促進した。線維芽細胞様の細胞が十分増殖した培養皿に対してdexamethasone,beta-glycerol phosphate,ascorbic acidを含む骨芽細胞分化誘導培地を加えて培養を継続した。分化誘導培地を加えることにより細胞形態は線維芽細胞様の形態から立方状の形態へと変化し、Von Kossa染色により細胞周囲のカルシウムの沈着を認めた。また同時に、多核巨細胞の存在も示された。フローサイトメトリーによる表面抗原の検索では、CD29,44,105の発現を高率に認めた。血球系幹細胞のマーカーであるCD34の発現も認められた。以上から臍帯血、及び胎盤血中には比重遠心法により分離されるプラスティック接着性の細胞が存在し、骨芽細胞分化誘導培地により骨芽細胞へと分化誘導可能な細胞が存在することが示された。表面抗原においても従来の報告による血球系細胞のマーカーだけではなく間葉系細胞のマーカーも高率に発現していた。以上を確認してから、ヌード・ラットの皮下に移植しin vivoでの骨組織の誘導を試みた。しかし、明らかな骨・軟骨組織は観察できなかった。そのため、フローサイトメトリーを用いたより詳細な表面抗原の調査と、より選択的な間葉系幹細胞の分離や培養条件の検索を行って、より分化能が高い細胞群の準備方法を続けて検討している。

对于无产妇并发症的病例，在分娩时获得父母书面同意后，用肝素采集脐带血和胎盘血。标本采集后24小时内进行处理。与前一年一样，使用Percoll (1.080g/ml)通过比重离心分离单核细胞。将分离的单核细胞接种于I型胶原包被的塑料皿（1×10^6细胞/cm^2）上，使用含有20%胎牛血清的DMEM培养基培养。此外，使用流式细胞术对一些收集和分离的单核细胞研究表面抗原的表达。搜索的表面抗原为CD14、29、34、44、68、105。在培养过程中，观察贴壁细胞的存在和集落的形成。当出现贴壁细胞时，添加bFGF (5 ng/ml)以促进细胞增殖。将含有地塞米松、磷酸β-甘油和抗坏血酸的成骨细胞分化培养基添加至成纤维细胞样细胞已充分生长的培养皿中，并继续培养。通过添加分化诱导培养基，细胞形态从成纤维细胞样变为立方体，Von Kossa染色显示细胞周围有钙沉积。同时，还证明了多核巨细胞的存在。通过流式细胞术寻找表面抗原揭示了 CD29,44,105 的高表达。还观察到了血细胞干细胞标记物 CD34 的表达。上述结果表明，脐带血和胎盘血中存在可通过比重离心分离的塑料粘附细胞，并且存在可使用成骨细胞分化培养基诱导分化为成骨细胞的细胞。在表面抗原中，不仅先前报道的血细胞标记物而且间充质细胞标记物都以高比率表达。确认上述情况后，我们将其皮下植入裸鼠体内，尝试在体内诱导骨组织。然而，没有观察到明显的骨或软骨组织。因此，我们将继续研究通过使用流式细胞术对表面抗原进行更详细的研究来制备具有更高分化潜力的细胞群的方法，并寻找更具选择性的间充质干细胞分离和培养条件。